Как защитить себя от энтеровирусной инфекции — 26 Сентября 2017

Энтеровирусные инфекции– это группа заболеваний, в основе причин которых лежит несколько разновидностей вирусов.

Причины заражения энтеровирусной инфекцией.

Заражение происходит несколькими путями. Вирусы в окружающую среду могут попадать от больного ребенка или от ребенка, который является вирусоносителем. Вирусоносительство может сохраняться на протяжении 5 месяцев.

Как передается энтеровирусная инфекция.

Механизм передачи может быть воздушно-капельный (при чихании и кашле с капельками слюны от больного ребенка к здоровому) и фекально-оральный при не соблюдении правил личной гигиены. Чаще всего заражение происходит через воду, при употреблении сырой (не кипяченой) воды. Симптомы энтеровирусной инфекции.

В организм вирусы попадают через рот или верхние дыхательные пути.. Инкубационный период (период от попадания вируса в организм ребенка, до появления первых клинических признаков) у всех энтеровирусных инфекций одинаковый – от 1 до 10 дней (чаще 2-5 дней).

Заболевание начинается остро — с повышения температуры тела до 38-39º С.

Лечение энтеровирусной инфекции.

Специфического лечения энтеровирусной инфекции не существует. Лечение проводят в домашних условиях, госпитализация показана при наличии поражения нервной системы, сердца, высокой температуры, которая долго не поддается снижению при использовании жаропонижающих средств. Ребенку показан постельный режим на весь период повышения температуры тела.

Дети изолируются на весь период заболевания. В детском коллективе могут находиться после исчезновения всех симптомов заболевания.

Профилактика энтеровирусной инфекции.

Для профилактики необходимо соблюдение правил личной гигиены: мыть руки после посещения туалета, прогулки на улице, пить только кипяченую воду или воду из заводской бутылки, недопустимо использование для питья ребенка воды из открытого источника (река, озеро).

Специфической вакцины против энтеровирусной инфекции не существует, так как в окружающей среде присутствует большое количество серотипов этих вирусов.

При первых признаках заболевания у ребенка –

незамедлительно обращайтесь к врачу!!!

КАК ЗАЩИТИТЬ СЕБЯ ОТ ЭНТЕРОВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ

Энтеровирусные инфекции (ЭВИ) — группа острых заболеваний, вызываемых энтеровирусами, характеризующихся многообразием клинических проявлений от легких лихорадочных состояний до тяжелых менингитов.

Энтеровирусы устойчивы во внешней среде и длительное время могут сохраняться в сточных водах, плавательных бассейнах, открытых водоемах, предметах обихода, продуктах питания (молоко, фрукты, овощи). Вирус быстро погибает при прогревании, кипячении.

ЭВИ характеризуются быстрым распространением заболевания.

Возможные пути передачи инфекции: воздушно-капельный, контактно-бытовой, пищевой и водный.

Серозный вирусный менингит является наиболее типичной и тяжелой формой энтеровирусной инфекции.

Источником инфекции являются больные и вирусоносители, в том числе больные бессимптомной формой.

Заболевание начинается остро, с подъема температуры тела до 39-40 градусов. Появляется сильная головная боль, головокружение, рвота, иногда боли в животе, спине, судорожный синдром, нередко выраженные катаральные проявления со стороны ротоглотки, верхних дыхательных путей. При появлении аналогичных жалоб необходимо срочно изолировать больного, т.к. он является источником заражения, для окружающих, и обратиться к врачу.

Для предупреждения заболевания энтеровирусной инфекции необходимо соблюдать меры профилактики, в основном, те же, что и при кишечных инфекциях:

1.      Употреблять гарантированно безопасную воду и напитки (кипяченная вода и напитки в фабричной упаковке).

2.      Употреблять в пищу продукты, прошедшие термическую обработку.

3.      Тщательно мыть фрукты и овощи безопасной водой и последующим ополаскиванием кипятком.

4.      Не допускать при купании в водоемах и бассейнах, попадания воды в полость рта.

5.      Соблюдать элементарные правила личной гигиены.

6.      Следует избегать посещения массовых мероприятий, мест с большим количеством людей (общественный транспорт, кинотеатры и т.д.).

7.      Рекомендуется влажная уборка жилых помещений не реже 2 раз в день, проветривание помещений.

8.      Ни в коем случае не допускать посещения ребенком организованного детского коллектива (школа, детские дошкольные учреждения) с любыми проявлениями заболевания. При первых признаках заболевания необходимо немедленно обращаться за медицинской помощью, не заниматься самолечением!

Covid-мутанты: что мы знаем о разных штаммах коронавируса?

• Ольга Дьяконова
• Би-би-си

30 октября 2020

Автор фото, Artem Geodakyan/TASS

По мере развития пандемии Covid-19 вызывающий это заболевание коронавирус SARS-CoV-2 продолжает мутировать, то есть изменяться. А значит, меняются и его свойства, причем новые штаммы вполне могут представлять большую угрозу — например, легче передаваться от человека к человеку или вызывать более тяжелое заболевание.

Уже описаны случаи повторного заражения, когда выздоровевший человек заболевал снова, встретившись с другой версией той же инфекции — причем известно, что болезнь в таком случае может протекать даже в более тяжелой форме.

Какие штаммы вируса известны ученым на данный момент и насколько они опасны? И сможет ли потенциальная вакцина защитить от всех известных вариаций коронавируса?

Что такое штамм?

Каждый вирус имеет свой геном — уникальную специфическую последовательность ДНК или РНК.

Геном SARS-CoV-2 — это длинная последовательность РНК, состоящая примерно из почти 30 тысяч знаков (нуклеотидов), идущих друг за другом в строгом порядке. Этот порядок может меняться: при сборке каждой новой копии вируса в любом из этих звеньев может произойти ошибка — замена одного нуклеотида другим, — и в результате немного изменится код всей цепочки.

В каждом новом «хозяине» геном вируса немного изменяется. Эти изменения могут быть совсем незначительными, но они позволяют установить связь между инфицированными или проследить путь, который проделал вирус.

Используя слово «штамм», ученые имеют в виду генетически отличную ветвь вируса, отличающуюся одной или несколькими мутациями от своего «родителя». Разница может составлять лишь долю процента от всего генома, но каждая новая последовательность РНК может положить начало новой ветви вируса — то есть новому штамму.

Скорость, с которой происходят генетические изменения, у разных вирусов различна — и SARS-CoV-2 мутирует относительно медленно. Большинство геномов этого вируса отличаются друг от друга небольшим количеством точечных замен, а число отличий от исходного варианта не превышает 30 на почти 30 тысяч нуклеотидов.

Какие штаммы коронавируса существуют?

Основных штаммов нового коронавируса семь, они обозначаются буквами GR, G, GH, O, S, L и V. Все началось со штамма L — именно его обнаружили в китайском Ухане в декабре 2019 года. Однако теперь он постепенно исчезает.

Остальные штаммы распределены по миру неоднородно: на каждом континенте наиболее распространено, как правило, не более двух основных вариаций. Их распространение можно наблюдать на составленной учеными интерактивной карте Nextstrain, отслеживающей мутации вируса.

Российский научный центр «Вектор» в октябре сообщил, что выявил более 80 мутаций коронавируса на территории страны. Но широко распространены в основном два штамма — европейский и азиатский, сообщили в Роспотребнадзоре. При этом последний завезен не из Китая, а из других азиатских стран.

Эти два штамма находят у 99% исследуемых образцов в России, сообщали в ведомстве.

Как вирус мутировал в России?

«Общее число мутаций, которые в совокупности выявлены в секвенированных геномах вируса SARS-CoV-2, составляет многие тысячи, однако только единичные из них зафиксировались и стабильно наследуются», — поясняют в Роспотребнадзоре. Сейчас насчитывается около 22 таких единичных мутаций, они произошли в январе-марте этого года. Позднее новые штаммы уже широко не распространялись, считают в ведомстве.

В начале эпидемии в России в геноме вируса стабильно зафиксировались три основные группы мутаций, которые сформировали, по данным исследования Роспотребнадзора, «три ветви эволюционного развития». К концу марта 2020 года развитие этих трех направлений замедляется — и основными циркулирующими в стране стали штаммы с мутацией в гене ORF1b (P314L) и S (D614G).

Эти две мутации стали самым существенным устойчивым изменением в геноме вируса SARS-CoV-2, подчеркивается в исследовании. В Роспотребнадзоре считают, что мутация в гене S ассоциируется со снижением патогенности (способности вызывать заболевание, проникая в организм). Ведомство отмечает, что это можно объяснить и улучшением лечения больных в течение пандемии.

Влияние мутации в гене ORF1b (P314L) еще мало изучено.

Автор фото, Kirill Kukhmar/TASS

Подпись к фото,

Изучением генома коронавируса в России занимаются научные центры «Вектор» и Чумакова. Эти же центры недавно разработали две потенциальные вакцины

«Вирусы мутируют постоянно, однако коронавирусы мутируют значительно медленнее по сравнению с другими РНК-вирусами», — рассказывает Любовь Козловская, заведующая лабораторией полиомиелита и других энтеровирусных инфекций федерального научного центра исследований и разработки иммунобиологических препаратов им. М.П. Чумакова.

«Несмотря на активную циркуляцию по всему миру, SARS-CoV-2 изменился менее чем на 0,1% по сравнению с вирусом, изначально выделенным в Китае 11 месяцев назад. Основные изменения выявлены в первые месяцы распространения, и варианты вируса, широко циркулирующие в настоящее время, сходны с теми, которые выделяли весной», — говорит Козловская.

Штамм S (D614G) сейчас является объектом пристального внимания ученых. Его впервые выявили в Индонезии в августе; тогда сообщалось, что этот штамм якобы в 10 раз более заразен, чем первоначальный штамм вируса.

Некоторые исследования, которые пока находятся на стадии препринта (то есть не отрецензированы и не опубликованы в научных изданиях), приходят к выводу, что у этой мутации действительно может быть более высокая инфицирующая способность, а вирусная нагрузка при инфицировании этим штаммом — более высокой. Но окончательных выводов по этому поводу нет.

«Вирус довольно быстро приобрёл замену в поверхностном белке вириона S (спайк), которая увеличивает его контагиозность (свойство инфекционных болезней передаваться от больных организмов — здоровым — Би-би-си), но не утяжеляет течение заболевания», — рассказывает Козловская. По ее словам, остальные отличия в штаммах вируса минимальны.

Первые варианты вируса с распространенными в России двумя мутациями выявлены в конце января в Китае, затем — в Австралии. В феврале эти варианты обнаружили в большинстве стран Западной Европы, Саудовской Аравии, США, Канаде, Мексике, Бразилии, Марокко и Сенегале.

Детальное сравнение геномов вируса на территории России и зарубежных стран говорит о том, что в стране циркулируют штаммы, завезенные из Западной Европы. Их завезли в марте и апреле 2020 года, отмечают в Роспотребнадзоре.

«[Коронавирус] в течение этих девяти месяцев мутировал очень мало и не изменялся в тех его локусах, которые отвечают за проявления эпидпроцесса, за его, так скажем, агрессивность и злость», — заявила на прошлой неделе глава Роспотребнадзора Анна Попова. В ведомстве считают, что у вируса низкая способность к мутациям — он накапливает лишь около двух точечных замен в месяц, то есть за год может произойти около 24 мутаций.

«Распределение основных вариантов вируса, циркулирующих в России, в общем похоже на таковое в Европе. Некоторые отличия наблюдаются, но у нас нет оснований полагать, что эти отличия как-то изменяют клиническое течение или эпидемиологию Covid-19 в России по сравнению со странами Европы», — говорит Козловская из центра им. М.П. Чумакова.

В Роспотребнадзоре в ответ на запрос Би-би-си сообщили, что ежемесячно ученые ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» расшифровывают полностью более 150 геномов нового коронавируса. «Получаемые данные используются для анализа актуальности используемых диагностических тест-систем, помогают выявлять завозные случаи, оценивать региональные особенности генетического разнообразия SARS-CoV-2», — заявили в ведомстве.

Сейчас проводится секвенирование геномов вирусов и накопление данных в различных лабораториях по всему миру, в том числе и в центре Чумакова, рассказывает Козловская. Ученые, по ее словам, проведут корелляции геномов вирусов с клинической картиной пациентов, от которых они выделены, что даст возможность пролить свет на значение наиболее распространенных мутаций.

Изучить влияние каждой конкретной мутации на клиническую картину заболевания Covid-19 сложно, признает она. Ученым предстоит изучить значение каждой конкретной мутации для структуры мутантных белков, а также определить роль этих мутаций в развитии клинических симптомов и поражения легких в экспериментах на животных.

В «Векторе» не ответили на вопросы Би-би-си относительно процесса изучения штаммов коронавируса. Там, как и в ФНЦИРИП им. М.П. Чумакова, на данный момент разработали и анонсировали новые вакцины от SARS-CoV-2, которые ждут клинических исследований.

Стоит ли бояться мутаций?

Основные вопросы, которые стоят перед учеными в связи с мутациями коронавируса — это способность вакцины сформировать иммунную защиту, которая будет одинаково устойчива к разным штаммам. Важен также вопрос различий в воздействии на инфицированного — например, могут ли одни штаммы быть заразнее других.

Из заявлений Роспотребнадзора следует, что мутации вируса не так страшны. Но в научной литературе уже сообщалось о нескольких случаях повторного заражения коронавирусом.

Чтобы признать заражение повторным, ученые каждый раз проверяют генетический состав возбудителя и убеждаются, что штамм вируса отличается от того, что вызвал заболевание в первый раз — иначе нельзя с уверенностью утверждать, что это именно вторичная инфекция, а не затянувшийся первичный случай.

Голландское информагентство BNO ведет счетчик всех повторных заболеваний, о которых когда-либо сообщалось, сопроводив каждый ссылкой на источник. Согласно информации агентства, в мире известно о 24 случаях повторных заражений, одно из них стало смертельным. Умерла 89-летняя пациентка из Нидерландов с онкологическим заболеванием.

Повторные заражения происходили также в Гонконге, Бельгии, США и Эквадоре.

«Каждый день в России регистрируется почти 20 тысяч случаев заболевания, часть из них ассоциированы с вирусами, давно циркулирующими на территории страны, часть — с импортированными вариантами, ассоциированными с заражением вирусом на территории других стран, часто очень отдаленных, — рассказывает Любовь Козловская. — Поэтому, конечно, возможен завоз и последующее выделение варианта вируса, который ранее не встречался в России, как это недавно произошло в Норвегии. Однако, по ее словам, это не означает моментальное изменение эпидемиологической ситуации с Covid-19.

В октябре в журнале Lancet было опубликовано исследование, описывающее два случая повторного заражения коронавирусной инфекцией. У одного из пациентов из штата Невада, США после повторного заражения болезнь протекала тяжелее. 25-летнему больному потребовалась госпитализация из-за кислородной недостаточности, компьютерная томография выявила у него наличие вирусной пневмонии.

Ученые выяснили, что он заразился другим штаммом, генетически отличным от прошлого возбудителя болезни. «Таким образом, прошлое воздействие SARS-CoV-2 может не гарантировать полного иммунитета», — делают вывод ученые. Они напоминают, что все люди, независимо от того, был ли у них ранее диагностирован коронавирус или нет, должны принимать одни и те же меры предосторожности.

Будут ли эффективны вакцины, если вирус мутирует?

Известно, что коронавирус мутирует медленнее, чем вирус гриппа: по разным оценкам, в два раза медленнее или на треть. В связи с этим вакцина от коронавируса «вероятно, будет стабильной и эффективной дольше, чем вакцина против гриппа», — говорит в беседе с HuffPost почетный доцент и клинический вирусолог университета Лестера Джулиан Танг.

При этом пока неизвестно, как долго будет сохраняться приобретенный с помощью вакцины иммунитет, даже если она будет работать как следует, напоминает ученый. Эффективность вакцины может зависеть и от индивидуальных особенностей организма — так же, как и у вакцины против гриппа, говорит Танг.

Пока что ученые считают, что вакцины, разрабатываемые во всем мире для борьбы с первыми штаммами нового коронавируса, будут столь же эффективны и в отношении новых мутаций. Исследование австралийских и американских ученых, которое проводили с помощью компьютерного моделирования и опытов на хорьках, 8 октября опубликовал научный журнал NPJ Vaccines. Животным вводили потенциальную вакцину INO-4800, разработанную американской компанией Inovio Pharmaceuticals.

Большинство вакцин, разрабатываемых во всем мире, были смоделированы на основе исходного D-штамма вируса, который был более распространен среди последовательностей, опубликованных в начале пандемии, пояснили ученые.

С тех пор вирус мутировал в штамм G, вариации которого сейчас являются доминирующими по всему миру. У исследователей были опасения, что эта мутация негативно отразится на эффективности разрабатываемых вакцин.

Автор фото, AFK Sistema

Подпись к фото,

Пока ученые склоняются к тому, что кандидаты на вакцину будут эффективны для любых штаммов коронавируса

«Несмотря на мутацию D614G в шиповидном белке, мы подтвердили экспериментами и моделированием, что вакцины-кандидаты по-прежнему эффективны», — заявил один из авторов исследования, профессор Йоркского университета Сешадри Васан.

По словам ученого, обнаружилось, что наиболее часто встречающийся штамм G вряд ли потребует частого подбора новых вакцин — в отличие от гриппа, вакцину от циркулирующих штаммов которого разрабатывают каждый год.

Так как отличия штаммов, циркулирующих в России, минимальны они, скорее всего, не оказывают значительного влияния на структуру вирусных белков, говорит Любовь Козловская из центра им. М.П. Чумакова. Это, по ее словам, делает возможным создание и применение вакцины от Covid-19, которую не придется переделывать каждый год.

Не стоит забывать, что ни одна из разработок вакцин в мире пока не прошла третью фазу клинических исследований, в которых делается вывод о ее эффективности.

В России эту стадию сейчас проходит вакцина центра имени Гамалеи «Спутник V». Две другие российские вакцины лишь готовятся к прохождению этой стадии.

Только после этих исследований, в которых примут участие десятки тысяч человек, можно будет делать выводы по поводу стойкости сформированного вакцинами иммунитета к коронавирусу.

Владимирские медики призывают к бдительности в преддверии сезона энтеровирусной инфекции

Энтеровирусная инфекция – это группа заболеваний, вызываемых несколькими разновидностями вирусов (вирусы Коксаки, поливирусы, эховирусы). Заболевание имеет сезонность и чаще всего развивается летом.

По данным регионального управления Роспотребнадзора, во Владимирской области за шесть месяцев 2019 года было зарегистрировано 2 случая заболевания энтеровирусной инфекцией, все заболевшие – дети.

Заражение может происходить воздушно-капельным путем (при чихании, кашле, с капельками слюны больного ребёнка или вирусоносителя), а также при несоблюдении правил личной гигиены. Чаще всего заражение происходит через употребление некипяченой воды, через общие игрушки, если дети берут их в рот.

Заболевание начинается остро, с подъёма температуры, болей в мышцах, увеличения шейных лимфатических узлов. На слизистой полости рта, миндалинах появляются высыпания в виде пузырьков. У ребёнка появляются боли в горле при глотании, боли при жевании. Может быть сыпь на коже туловища, ладонях, стопах.

Энтеровирусы могут поражать центральную нервную систему и вызывать энтеровирусный менингит. При поражении кишечника может наблюдаться жидкий стул. При поражении печени может развиться острый гепатит. Энтеровирусная инфекция способна поражать мышцу сердца с развитием эндокардита.

При появлении первых признаков заболевания необходимо срочно показать ребёнка врачу. Лёгкие формы заболевания не требуют госпитализации. При поражении центральной нервной системы и развития менингита, энцефалита – госпитализация необходима. Заболевание протекает, как правило, в течение 5-6 дней и заканчивается выздоровлением. Летальных случаев энтеровирусной инфекции нет.

Профилактика энтеровирусной инфекции: соблюдение личной гигиены, мытье рук перед едой, питьё только кипячёной воды или воды из заводской бутылки, тщательное мытьё игрушек. Во время купания не следует заглатывать воду.

Вакцины против энтеровирусной инфекции не существует.

Памятка по профилактике энтеровирусной инфекции

Энтеровирусные инфекции — группа острых заболеваний, вызываемых энтеровирусами, характеризующихся многообразием клинических проявлений от лёгких лихорадочных состояний до тяжёлых менингитов. Энтеровирусы устойчивы во внешней среде и длительное время могут сохраняться в сточных водах, плавательных бассейнах, открытых водоёмах, предметах обихода, продуктах питания (молоко, фрукты, овощи). Вирус быстро погибает при прогревании, кипячении.

Энтеровирусные инфекции характеризуются быстрым распространением заболевания. Инкубационный период при энтеровирусных серозных менингитах составляет в среднем около 1 недели. Чаще болеют городские жители, преимущественно дети до 7 лет, посещающие детские дошкольные учреждения. Менингеальный синдром протекает обычно доброкачественно, с улучшением в течение нескольких дней. Сезонность — летне-осенняя, чаще май — август. Возможные пути передачи инфекции: воздушно-капельный, контактно-бытовой, пищевой и водный. Серозный вирусный менингит является наиболее типичной и тяжёлой формой энтеровирусной инфекции. Энтеровирусные инфекции характеризуются полиморфизмом клинических проявлений и множественными поражениями органов и систем: серозный менингит, геморрагический конъюнктивит, увеит, синдром острого вялого паралича (ОВП), заболевания с респираторным синдромом и другие. Один и тот же серотип энтеровируса способен вызывать развитие нескольких клинических синдромов и, наоборот, различные серотипы энтеровирусов могут вызвать сходные клинические проявления болезни. Наибольшую опасность представляют тяжёлые клинические формы с поражением нервной системы. Источником инфекции являются больные и вирусоносители, в том числе больные бессимптомной формой. Заболевание начинается остро, с подъёма температуры тела до 39-40 градусов. Появляется сильная головная боль, головокружение, рвота, иногда боли в животе, спине, судорожный синдром, нередко выраженные катаральные проявления со стороны ротоглотки, верхних дыхательных путей. При появлении аналогичных жалоб необходимо срочно изолировать больного, т.к. он является источником заражения, для окружающих, и обратиться к врачу. Специфической вакцины против энтеровирусной инфекции не существует. Учитывая возможные пути передачи, меры личной профилактики должны заключаться в соблюдении правил личной гигиены.

Чтобы предупредить энтеровирусную инфекцию: • Не контактируйте с лицами, имеющими признаки заболевания; • Соблюдайте правила личной гигиены; мойте руки с мылом перед едой, после возвращения с улицы и посещения туалета; обрабатывайте руки, разрешёнными для этих целей кожными антисептиками. • Промывайте полость носа с использованием медицинских спреев на основе морской воды, полощите ротовую полость отваром ромашки, особенно после улицы и общественного транспорта. • Пользуйтесь индивидуальной посудой, держите в чистоте детские соски, предметы ухода за детьми, игрушки. • Чаще проветривайте помещения, регулярную проводите влажную уборку. • Соблюдайте «респираторный этикет»: при кашле и чихании рекомендуется прикрывать нос и рот одноразовыми платками и выбрасывать их в урну после использования, затем вымыть руки или обработать влажной салфеткой. • Купайтесь только в разрешённых для этих целей местах. При купании в открытых водоёмах, плавательных бассейнах исключайте попадание воды в полость рта. Оберегайте своих детей от купания в фонтанах, в надувных бассейнах (модулях), используемых в игровых аттракционах; Помните, что это наиболее вероятная возможность заразиться; • Употребляйте для питья только бутилированную или кипячёную воду, напитки в фабричной упаковке. Избегайте использования для питья воды из случайных водоисточников — колодцев, фонтанов, ключей, озёр, рек и т.д.; • Приобретайте продукты в установленных местах, доброкачественные. Обращайте внимание на сроки годности и температуру хранения. • Тщательно мойте фрукты и овощи водой гарантированного качества (бутилированная, кипячёная) с последующим ополаскиванием кипятком. • В период сезонного подъёма заболеваемости ограничьте контакты детей раннего возраста, сократите время пребывания в местах массового скопления людей и в общественном транспорте. Ни в коем случае не допускайте посещения ребёнком организованного детского коллектива (школа, детские дошкольные учреждения) с любыми проявлениями заболевания.

При первых признаках заболевания необходимо немедленно обращаться за медицинской помощью, не заниматься самолечением! Будьте внимательнее к своему здоровью и соблюдайте рекомендованные правила профилактики!

По информации Серпуховского территориального отдела Управления Роспотребнадзора по Московской области

Энтеровирусная инфекция и ее профилактика

Энтеровирусные инфекции (ЭВИ) представляют собой группу острых инфекционных заболеваний вирусной этиологии, вызываемые различными представителями энтеровирусов.

Энтеровирусные инфекции (ЭВИ) представляют собой группу острых инфекционных заболеваний вирусной этиологии, вызываемые различными представителями энтеровирусов.

Наибольшее количество случаев энтеровирусной инфекцией, как правило, наблюдается в летние и осенние месяцы года. Однако заболевание энтеровирусной инфекцией может возникнуть в любое время года.

Энтеровирусы отличаются высокой устойчивостью во внешней среде и длительное время могут сохраняться в сточных водах, плавательных бассейнах, открытых водоемах, на предметах обихода, продуктах питания (молоко, фрукты, овощи).

КАК происходит заражение

Источником инфекции является больной человек или носитель вируса. Особенно опасны бессимптомные носители заболевания.

Основной механизм передачи возбудителя — фекально-оральный, он реализуется водным, пищевым и контактно-бытовым путями. Возможна передача инфекции воздушно-капельным и пылевым путями.

Энтеровирусная инфекция характеризуется быстрым распространением среди населения. Заразиться можно при несоблюдении правил личной гигиены (через грязные руки), при употреблении зараженной воды или пищи, а также при непосредственном контакте с зараженными предметами.

Инкубационный период составляет в среднем — от 1 до 10 дней. Для заражения не требуется большое количество вируса. Именно с этим связана большая распространенность этой инфекции, особенно среди детей и других людей, имеющих низкий иммунитет. Преимущественно болеют дети младшего и школьного возраста.

КАК проявляется инфекция

Энтеровирусная инфекция характеризуются многообразием клинических проявлений и множественными поражениями органов и систем: серозный менингит, менингоэнцефалит, геморрагический конъюнктивит, гастроэнтерит, заболевания с респираторным синдромом и другие. Наибольшую опасность представляют тяжелые клинические формы с поражением нервной системы (менингиты, энцефалиты, менингоэнцефалиты, миелиты).

Заболевание начинается остро с подъема температуры тела до 39-40 градусов. Появляется сильная головная боль, головокружение, рвота, иногда боли в животе, спине, судорожный синдром, изъязвления на слизистых в полости рта, высыпания на лице, конечностях, возможны не резко выраженные катаральные проявления со стороны ротоглотки, верхних дыхательных путей, расстройство желудочно-кишечного тракта.

Серозный менингит является наиболее типичной и тяжелой формой энтеровирусной инфекции. Особенностями проявления являются распирающая головная боль с локализацией в лобно-височной, реже затылочной области и рвота, не связанная с приемом пищи и не приносящая больному облегчения.

КАК предупредить заболевание

Чтобы свести риск заражения энтеровирусной инфекцией до минимума, рекомендуем придерживаться следующих правил:

• Не контактируйте с лицами, имеющими признаки заболевания;

• Соблюдайте элементарные правила личной гигиены, мойте руки перед едой, после туалета, перед приготовлением пищи.

• Пользуйтесь индивидуальной посудой, держите в чистоте детские соски, предметы ухода за детьми;

• Проводите влажную уборку, чаще проветривайте помещения;

• Тщательно мойте фрукты и овощи водой гарантированного качества.

• Не купайтесь в не установленных (не отведённых) для этих целей местах. При купании в открытых водоемах, старайтесь не допускать попадания воды в полость рта. Помните, что это наиболее вероятная возможность заразиться.

• Оберегайте своих детей от купания в фонтанах, в надувных бассейнах (модулях), используемых в игровых аттракционах.

• Употребляйте для питья только кипяченую или бутилированную воду и напитки в фабричной расфасовке. Избегайте использования для питья воды из случайных водоисточников — колодцев, фонтанов, ключей, озер, рек и т.д.

• Не реже 1 раза в день, а если в семье имеются дети до 3 лет, 2 раза в день, мойте игрушки с применением моющих средств.

• Ограничьте контакты детей раннего возраста, сократите время пребывания в местах массового скопления людей и в общественном транспорте.

При появлении признаков заболевания необходимо срочно изолировать больного, т.к. он является источником заражения для окружающих, и обратиться за медицинской помощью (вызвать врача на дом).

При лечении лёгких форм ЭВИ на дому, заболевшему нужно выделить отдельную столовую посуду, по возможности отдельную комнату, где проводить проветривание и ежедневную влажную уборку с использованием дезсредств. Если в семье несколько детей необходимо по возможности разобщить больных и здоровых детей.

Особую осторожность необходимо проявлять в период зарубежных поездок. Неблагополучная ситуация по ЭВИ сложилась в странах Юго-Восточной Азии.

Не допускайте детей с проявлениями симптомов инфекционного заболевания к посещению образовательных учреждений, бассейнов, кружков

Будь в курсе — энтеровирусная инфекция! — Последние новости — Новости — Главная — Официальный сайт Администрации Полевского городского округа

4 октября 2018

Будь в курсе — энтеровирусная инфекция!

Одно из острых инфекционных заболеваний — энтеровирусная инфекция (ЭВИ), которое характеризуется высокой контагиозностью и быстрым распространением заболевания, вызывается различными представителями кишечных вирусов (энтеровирусов) с многообразием клиниче

 Регистрируется в течение всего года, максимальная заболеваемость ЭВИ приходится на летне-осенние месяцы.

Так, в Полевском городском округе за 8 месяцев зарегистрировано по предварительному диагнозу 1 случай вирусного менингита у взрослого, в аналогичный период 2017г. и за среднемноголетний уровень, случаев заболевания не зарегистрировано. 1 случай ЭВИ экзантемы зарегистрирован среди детей от 1 года до 2х лет посещающих ДДУ.

  Инфекция передается воздушно-капельным, пищевым и контактно-бытовым путями. Источником являются больные люди, вирусоносители, больные бессимптомной формой.

Энтеровирусы устойчивы во внешней среде и длительное время могут сохраняться в сточных водах, плавательных бассейнах, открытых водоёмах, на предметах обихода, продуктах питания (молоко, фрукты, овощи). Вирус быстро погибает при прогревании, кипячении.

  Заболевание начинается остро, с подъёма температуры тела до 39-40 градусов. Появляется сильная головная боль, головокружение, рвота, иногда боли в животе, спине, судорожный синдром, не резко выраженные катаральные проявления со стороны ротоглотки, верхних дыхательных путей. Серозный вирусный менингит является наиболее типичной и тяжелой формой энтеровирусной инфекции.

  Инфекцией в 60% случаев болеют дети. Ни в коем случае нельзя допускать посещения заболевшим ребенком организованного детского коллектива. Принимаются оперативно противоэпидемические мероприятия по разобщению коллектива.

 Одна из форм разобщения – перевод на дистанционное обучение.

Назад к списку

Памятка по профилактике энтеровирусной инфекции

Энтеровирусные инфекции — группа острых заболеваний, вызываемых энтеровирусами, характеризующихся многообразием клинических проявлений от лёгких лихорадочных состояний до тяжёлых менингитов. Энтеровирусы устойчивы во внешней среде и длительное время могут сохраняться в сточных водах, плавательных бассейнах, открытых водоёмах, предметах обихода, продуктах питания (молоко, фрукты, овощи). Вирус быстро погибает при прогревании, кипячении.

Энтеровирусные инфекции характеризуются быстрым распространением заболевания. Инкубационный период при энтеровирусных серозных менингитах составляет в среднем около 1 недели. Чаще болеют городские жители, преимущественно дети до 7 лет, посещающие детские дошкольные учреждения. Менингеальный синдром протекает обычно доброкачественно, с улучшением в течение нескольких дней. Сезонность — летне-осенняя, чаще май — август. Возможные пути передачи инфекции: воздушно-капельный, контактно-бытовой, пищевой и водный. Серозный вирусный менингит является наиболее типичной и тяжёлой формой энтеровирусной инфекции. Энтеровирусные инфекции характеризуются полиморфизмом клинических проявлений и множественными поражениями органов и систем: серозный менингит, геморрагический конъюнктивит, увеит, синдром острого вялого паралича (ОВП), заболевания с респираторным синдромом и другие. Один и тот же серотип энтеровируса способен вызывать развитие нескольких клинических синдромов и, наоборот, различные серотипы энтеровирусов могут вызвать сходные клинические проявления болезни. Наибольшую опасность представляют тяжёлые клинические формы с поражением нервной системы. Источником инфекции являются больные и вирусоносители, в том числе больные бессимптомной формой. Заболевание начинается остро, с подъёма температуры тела до 39-40 градусов. Появляется сильная головная боль, головокружение, рвота, иногда боли в животе, спине, судорожный синдром, нередко выраженные катаральные проявления со стороны ротоглотки, верхних дыхательных путей. При появлении аналогичных жалоб необходимо срочно изолировать больного, т.к. он является источником заражения, для окружающих, и обратиться к врачу. Специфической вакцины против энтеровирусной инфекции не существует. Учитывая возможные пути передачи, меры личной профилактики должны заключаться в соблюдении правил личной гигиены.

Чтобы предупредить энтеровирусную инфекцию: • Не контактируйте с лицами, имеющими признаки заболевания; • Соблюдайте правила личной гигиены; мойте руки с мылом перед едой, после возвращения с улицы и посещения туалета; обрабатывайте руки, разрешёнными для этих целей кожными антисептиками. • Промывайте полость носа с использованием медицинских спреев на основе морской воды, полощите ротовую полость отваром ромашки, особенно после улицы и общественного транспорта. • Пользуйтесь индивидуальной посудой, держите в чистоте детские соски, предметы ухода за детьми, игрушки. • Чаще проветривайте помещения, регулярную проводите влажную уборку. • Соблюдайте «респираторный этикет»: при кашле и чихании рекомендуется прикрывать нос и рот одноразовыми платками и выбрасывать их в урну после использования, затем вымыть руки или обработать влажной салфеткой. • Купайтесь только в разрешённых для этих целей местах. При купании в открытых водоёмах, плавательных бассейнах исключайте попадание воды в полость рта. Оберегайте своих детей от купания в фонтанах, в надувных бассейнах (модулях), используемых в игровых аттракционах; Помните, что это наиболее вероятная возможность заразиться; • Употребляйте для питья только бутилированную или кипячёную воду, напитки в фабричной упаковке. Избегайте использования для питья воды из случайных водоисточников — колодцев, фонтанов, ключей, озёр, рек и т.д.; • Приобретайте продукты в установленных местах, доброкачественные. Обращайте внимание на сроки годности и температуру хранения. • Тщательно мойте фрукты и овощи водой гарантированного качества (бутилированная, кипячёная) с последующим ополаскиванием кипятком. • В период сезонного подъёма заболеваемости ограничьте контакты детей раннего возраста, сократите время пребывания в местах массового скопления людей и в общественном транспорте. Ни в коем случае не допускайте посещения ребёнком организованного детского коллектива (школа, детские дошкольные учреждения) с любыми проявлениями заболевания.

При первых признаках заболевания необходимо немедленно обращаться за медицинской помощью, не заниматься самолечением! Будьте внимательнее к своему здоровью и соблюдайте рекомендованные правила профилактики!

По информации Серпуховского территориального отдела Управления Роспотребнадзора по Московской области

Журнал детских инфекционных болезней

Что вы по профессии? Academic MedicineAcute Уход NursingAddiction MedicineAdministrationAdvanced Практика NursingAllergy и ImmunologyAllied здоровьеАльтернативная и комплементарной MedicineAnesthesiologyAnesthesiology NursingAudiology & Ear и HearingBasic ScienceCardiologyCardiothoracic SurgeryCardiovascular NursingCardiovascular SurgeryChild NeurologyChild PsychiatryChiropracticsClinical SciencesColorectal SurgeryCommunity HealthCritical CareCritical Уход NursingDentistryDermatologyEmergency MedicineEmergency NursingEndocrinologyEndoncrinologyForensic MedicineGastroenterologyGeneral SurgeryGeneticsGeriatricsGynecologic OncologyHand SurgeryHead & Neck SurgeryHematology / OncologyHospice & Паллиативная CareHospital MedicineInfectious DiseaseInfusion Сестринское делоВнутреннее / Лечебное делоВнутреннее / Лечебное отделениеБиблиотечные науки Уход за матерью и детьмиМедицинская онкологияМедицинские исследованияНеонатальный / Перинатальный Неонатальный / Перинатальный уход ecialtiesNursing-educationNutrition & DieteticsObstetrics & GynecologyObstetrics & Gynecology NursingOccupational & Environmental MedicineOncology NursingOncology SurgeryOphthalmology / OptometryOral и челюстно SurgeryOrthopedic NursingOrthopedics / Позвоночник / Спорт Медицина SurgeryOtolaryngologyPain MedicinePathologyPediatric SurgeryPediatricsPharmacologyPharmacyPhysical Медицина и RehabilitationPhysical Терапия и женщин Здоровье Физическое TherapyPlastic SurgeryPodiatary-generalPodiatry-generalPrimary Уход / Семейная медицина / Общие PracticePsychiatric Сестринское делоПсихиатрияПсихологияОбщественное здравоохранениеПульмонологияРадиационная онкология / ТерапияРадиологияРевматологияНавыки и процедурыСонотерапияСпорт и упражнения / Тренировки / ФитнесСпортивная медицинаХирургический уходПереходный уходТрансплантационная хирургияТерапия травмТравматическая хирургияУрологияЖенское здоровьеУход за ранамиДругое

Что ваша специальность? Addiction MedicineAllergy & Clinical ImmunologyAnesthesiologyAudiology & Speech-Language PathologyCardiologyCardiothoracic SurgeryCritical Уход MedicineDentistry, Oral Surgery & MedicineDermatologyDermatologic SurgeryEmergency MedicineEndocrinology & MetabolismFamily или General PracticeGastroenterology & HepatologyGenetic MedicineGeriatrics & GerontologyHematologyHospitalistImmunologyInfectious DiseasesInternal MedicineLegal / Forensic MedicineNephrologyNeurologyNeurosurgeryNursingNutrition & DieteticsObstetrics & GynecologyOncologyOphthalmologyOrthopedicsOtorhinolaryngologyPain ManagementPathologyPediatricsPlastic / Восстановительная SugeryPharmacology & PharmacyPhysiologyPsychiatryPsychologyPublic, Окружающая среда и гигиена трудаРадиология, ядерная медицина и медицинская визуализацияФизическая медицина и реабилитация Респираторная / легочная медицинаРевматологияСпортивная медицина / наукаХирургия (общая) Травматологическая хирургияТоксикологияТрансплантационная хирургияУрологияСосудистая хирургияВироло у меня нет медицинской специальности

Каковы ваши условия работы? Больница на 250 коекБольница на более 250 коекУправление престарелыми или хосписы Психиатрическое или реабилитационное учреждениеЧастная практикаГрупповая практикаКорпорация (фармацевтика, биотехнология, инженерия и т. Д.) Докторантура Университета или медицинского факультета Магистратура или 4-летнего академического университета Общественный колледж Правительство Другое

энтеровирусных инфекций свиней

Эпидемиология детских энтеровирусных инфекций в Ханчжоу, Китай | Журнал вирусологии

Передача сигналов интерферона типа III ограничивает инфицирование бокаловидными клетками энтеровирусом 71

Abstract

Недавние всемирные вспышки энтеровируса 71 (EV71) вызвали крупные эпидемии заболеваний рук, ног и рта с тяжелыми неврологическими осложнениями, включая острый вялый паралич.EV71 передается энтеральным путем, но мало что известно о механизмах, которые он использует для прохождения через желудочно-кишечный тракт человека. Используя первичные монослои кишечного эпителия человека, мы показали, что EV71 инфицирует эпителий с апикальной поверхности, где он преимущественно поражает бокаловидные клетки. Мы обнаружили, что инфекция EV71 не изменяет функцию эпителиального барьера, но действительно снижает экспрессию муцинов, происходящих из бокаловидных клеток, предполагая, что это изменяет функцию бокаловидных клеток. Мы также показываем, что эпителий кишечника отвечает на инфекцию EV71 посредством селективной индукции интерферонов типа III (IFN), которые ограничивают репликацию EV71.В совокупности эти данные определяют ранние события, связанные с инфекциями EV71 эпителия кишечника человека, и показывают, что передача сигналов IFN хозяина контролирует репликацию IFN-специфическим образом.

ВВЕДЕНИЕ

Энтеровирусы — это небольшие (~ 30 нм) вирусы с одноцепочечной РНК, которые вызывают широкий спектр заболеваний у людей. Проявления энтеровирусных инфекций могут варьироваться от острого, самоограничивающегося лихорадочного заболевания до менингита, эндокардита, острого паралича и даже смерти.Энтеровирус 71 (EV71) был связан с крупными эпидемиями болезней рук, ног и рта (HFMD) во всем мире и тяжелыми неврологическими осложнениями, включая менингит, энцефалит и острый вялый паралич (–1). Вспышки EV71, впервые выявленные в 1969 году ( 2 ), произошли по всему миру, причем эпидемии чаще всего происходят в Азиатско-Тихоокеанском регионе. В период с 2008 по 2012 год вспышки EV71 в Китае были связаны с более чем 7 000 000 случаев HFMD и почти 2500 случаями смерти ( 3 ).Педиатрическая популяция подвержена наибольшему риску развития осложнений, связанных с EV71, при этом подавляющее большинство летальных исходов приходится на детей в возрасте до двух лет ( 3 — 6 ). В настоящее время нет одобренных терапевтических средств для лечения или профилактики инфекций EV71.

EV71 передается фекально-оральным путем, где он нацеливается на эпителий желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) человека для инвазии хозяина. Механизмы, используемые EV71 для преодоления эпителиального барьера GI, остаются в значительной степени неизвестными, частично из-за отсутствия in vivo моделей для изучения инфекций EV71 энтеральным путем.Например, моделирование инфекций EV71 на моделях мышей является сложным, учитывая необходимость полагаться на использование адаптированных к мышам вирусных штаммов, животных, лишенных функциональной передачи сигналов интерферона (IFN), и / или мышей, сверхэкспрессирующих человеческий гомолог первичного рецептора EV71 SCARB2 ( 7 — 11 ). Предыдущая работа на нечеловеческих моделях приматов параллельна осложнениям центральной нервной системы, связанным с инфекциями EV71 у людей, в том числе при заражении энтеральным путем ( 8 , 12 , 13 ).Однако, несмотря на разработку этих моделей, которые предоставляют платформы для определения эффективности вакцин и терапевтических средств EV71 у животных, конкретные механизмы, с помощью которых EV71 пересекает эпителиальный барьер желудочно-кишечного тракта человека, еще предстоит определить.

Эпителий ЖКТ человека представляет собой сложный клеточный барьер, состоящий из нескольких типов клеток. Эти разнообразные типы клеток происходят из стволовых клеток рецептора 5 (Lgr5 ⁺ ), содержащих богатые лейцином повторы, связанных с рецептором 5 (Lgr5 ⁺ ), расположенных в основании кишечных крипт, которые дифференцируются на абсорбирующие и секреторные клоны ( 14 ).Основные достижения в разработке ex vivo «мини-кишечных» энтероидных моделей, в которых первичные кишечные крипты человека выделяются и культивируются в эпителиальные структуры, которые дифференцируются, чтобы содержать множество типов клеток, присутствующих в кишечнике человека, расширили наше понимание кишечного вируса. –GI взаимодействия [обзор в ( 15 )]. В предыдущей работе мы использовали энтероиды, выделенные из тонкого кишечника плода человека, для определения восприимчивости кишечника человека к энтеровирусным инфекциям, используя в качестве моделей эховирус 11 (E11), вирус Коксаки B (CVB) и EV71 ( 16 ).Мы показали, что E11 проявляет специфичность инфекции по типу клеток и инфицирует как энтероциты, так и энтероэндокринные клетки, но неспособен инфицировать бокаловидные клетки ( 16 ). Однако в ходе этих исследований мы отметили, что, в отличие от E11 и CVB, EV71 реплицировался до низких уровней в энтероидах человека, хотя механистическая основа этого оставалась неясной ( 16 ).

Хотя модель на основе крипт, использованная в нашей предыдущей работе, имеет много преимуществ по сравнению со стандартными моделями на основе клеточных линий, культивирование крипт в матригеле вызывает образование трехмерных структур, в которых просветный (апикальный) домен обращен внутрь, а базолатеральный домен обращен к культуральной среде.Это влияет на полярность, с помощью которой вирусы инфицируют энтероиды, ограничивает способность определять, существует ли полярность проникновения и / или высвобождения вируса, и препятствует оценке изменений, которые могут быть вызваны инфекцией в эпителии, таких как потеря барьерной функции. . Здесь мы разработали модель монослоя с использованием изолированных крипт плода человека, культивируемых на проницаемых пористых мембранных вставках, что приводит к формированию одноклеточного монослоя, содержащего все различные типы клеток, присутствующие в эпителии GI.Используя эту модель, мы обнаружили, что EV71 проявляет отчетливую апикальную полярность для инфицирования эпителия. Мы обнаружили, что в отличие от E11, который преимущественно нацелен на энтероциты и устраняет эпителиальную структуру и барьерную функцию, EV71 преимущественно инфицирует бокаловидные клетки, а инфекция снижает экспрессию муцинов, происходящих из бокаловидных клеток. Наконец, мы показываем, что инфекция EV71 специфически индуцирует IFN-λ2 / 3 типа III и что IFN типа I и III ограничивают репликацию энтеровирусов вирус-специфическим образом, причем IFN типа I оказывает наибольшее ограничение преимущественно на E11 и IFN типа III. ограничивая EV71.Более того, мы показываем, что передача сигналов IFN типа III ограничивает инфекцию EV71, поскольку обработка монослоев руксолитинибом ингибитором киназы Janus 1/2 (JAK1 / 2) ингибирует индуцированную EV71 индукцию IFN-стимулированного гена (ISG) и увеличивает инфицирование EV71. Таким образом, наши результаты определяют события, связанные с инфекциями EV71 в желудочно-кишечном тракте, которые могут привести к идентификации новых терапевтических целей и / или стратегий для предотвращения или лечения патогенеза и заболеваемости, связанных с инфекциями, вызванными этим вирусом.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Модель монослоя на основе крипт

Ранее мы выращивали энтероиды, полученные из кишечных крипт, выделенных из тонкого кишечника плода человека, культивированного в матригеле, и инфицировали их E11, CVB и EV71 ( 16 ). Здесь мы обнаружили, что EV71 плохо реплицируется по сравнению с другими энтеровирусами. Однако причина такого низкого уровня инфицирования не ясна. Учитывая, что энтероиды, культивируемые в матригеле, развивают апикальную поверхность, обращенную в просвет (рис.1A и рис. S1A), который недоступен из культуральной среды, мы предположили, что низкие уровни репликации EV71 в этой модели могут быть результатом необходимости инфицирования с базолатеральной поверхности. Поэтому мы определили, может ли прямое культивирование изолированных крипт на вставках Transwell пористой мембраны предоставить модель для оценки инфекции EV71 апикальной и базолатеральной поверхностей в интактном монослое. Для этого мы выделили кишечные крипты из тонкого кишечника плода человека и поместили их непосредственно на вставки T-clear Transwell в присутствии факторов, необходимых для стимуляции дифференцировки стволовых клеток [R-спондин, Noggin, эпидермальный фактор роста (EGF), Wnt3A, и ингибитор Rho-киназы Y-27632] (рис.S1B). Сходные модели были использованы из крипт, выделенных из желудочно-кишечного тракта взрослых, которые часто нуждаются в росте в виде энтероидов в Matrigel перед разрушением и последующим посевом Transwell [rev. ( 17 )]. Мы обнаружили, что крипты, полученные из тонкой кишки плода, помещенные непосредственно на вставки Transwell, развивались в полные монослои в течение 2-3 дней после посева и демонстрировали отдельные апикальные и базолатеральные домены, которые содержали различные типы кишечных клеток, такие как муцин-2 (MUC2) -положительные бокаловидные клетки. и хромогранин A (CHGA) — положительные энтероэндокринные клетки в том же соотношении, что и крипты, культивируемые в матригеле (рис.1A и рис. S1C). Используя секвенирование РНК (RNA-seq) и количественную полимеразную цепную реакцию с обратной транскрипцией (RT-qPCR), мы обнаружили, что крипты, помещенные непосредственно во вставки Transwell, демонстрируют сходные профили транскрипции, без значительных различий в этих профилях, как было оценено анализом DESeq2 в R ( 18 ) (рис. 1B), и маркеры экспрессии энтероцитов [сахароза-изомальтаза, щелочная фосфатаза (ALPL), бокаловидные клетки (MUC2, MUC5AC, MUC13 и MUC17), энтероэндокринные клетки (CHGA) и клетки Панета (регенерирующие протеин, полученный из островков 3)], что почти эквивалентно планшетам с криптами в матригеле, хотя мы действительно наблюдали значительно более низкую экспрессию Lgr5, что соответствует потере морфологии крипт в условиях монослоя (рис.1С). Помимо развития многоклеточного фенотипа, монослои крипт [далее называемые кишечным эпителием человека (ГИЭ)] состояли в основном из энтероцитов [что оценивалось по экспрессии маркеров соединения ZO-1 и E-кадгерина (рис. 1D) и ALPL (рис. S1D)] и продемонстрировал неповрежденную барьерную функцию, о чем свидетельствуют высокие (более примерно 1000 Ом) значения трансэпителиального сопротивления (TER) (рис. 1E).

Рис. 1 Создание монослоя человеческого плода, полученного из тонкой кишки.

( A ) Конфокальные микрофотографии изолированных крипт, выращенных в матригеле (слева) или на вставке Transwell T-clear (справа) в течение 6 дней. Иммунофлуоресцентные изображения монослоев, иммуноокрашенных на цитокератин-19 (Cyt-19) (эпителиальный маркер) (зеленый, вверху) и актин (красный, вверху) или хромогранин A (CHGA; энтероэндокринный маркер) (зеленый, внизу) и муцин-2 (MUC2; маркер кубка) (красный, внизу) показаны. В целом, ядра, окрашенные 4 ‘, 6-диамидино-2-фенилиндолом (DAPI), показаны синим цветом. Вверху и справа на верхней панели находятся изображения XYZ или XZY, полученные путем последовательного секционирования.( B ) Вулканический график анализа дифференциальной экспрессии на основе РНК-seq трех независимых препаратов изолированных крипт, нанесенных непосредственно на матригель или на вставки Transwell через 6 дней после посева. По данным анализа DESeq2, транскрипты не были обнаружены как значительно дифференцированно экспрессирующиеся в разных условиях культивирования (серые круги, P > 0,05). ( C ) ОТ-КПЦР для указанных маркеров [щелочная фосфатаза (ALPL), сахароза-изомальтаза (SI), CHGA, MUC2, регенерирующий белок 3 островкового происхождения (REG3A) и G-белок, содержащий богатые лейцином повторы — сопряженный рецептор 5 (LGR5)] в трех сопоставленных независимых культурах энтероидов человека (показаны как независимые символы), помещенных во вставки Matrigel или T-clear Transwell.Данные представлены как средние значения ± стандартное отклонение как кратное изменение для энтероидов, покрытых матригелем. Значимость определялась с использованием стандартного теста t , *** P <0,01; нс, не имеет значения. ( D ) Конфокальные микрофотографии изолированных крипт, выращенных на вставках Transwell T-clear в течение 6 дней. Показаны изображения иммунофлуоресценции от HIE, иммуноокрашенных на E-кадгерин (E-cad) (маркер соединения адгезивов в энтероцитах; зеленый), ZO-1 (маркер плотного соединения в энтероцитах; красный) и актин (пурпурный).Ядра, окрашенные DAPI, показаны синим цветом. Вверху и справа на верхней панели находятся изображения XYZ или XZY, полученные путем последовательного секционирования. ( E ) Значения трансэпителиального сопротивления (TER; в Ом) из пяти независимых культур HIE (от ENT-1 до ENT-5 серым цветом; от двух до трех Transwells усредняли для каждого препарата). Средние значения TER для всех препаратов показаны красным.

EV71 преимущественно заражает ГИЭ с апикальной поверхности

Неизвестно, проявляют ли энтеровирусы преимущественную полярность связывания или инфицирование при первичном ГИЭ.Чтобы решить эту проблему, мы выполнили анализы связывания и инфицирования либо с апикальной, либо с базолатеральной поверхностей в первичной ГИЭ. Эти исследования выявили значительные различия в способности E11 и EV71 связываться и инфицировать поляризованным образом. В то время как E11 проявлял повышенную способность к инфицированию с базолатеральной поверхности, что оценивалось по продукции вирусной РНК (vRNA) с помощью RT-qPCR через 24 часа после инфицирования (p.i.), EV71 проявлял гораздо более сильное предпочтение для апикальной инфекции (рис. 2A). В соответствии с этим мы обнаружили, что EV71 предпочтительно связывается с апикальной поверхностью HIE, как было определено с помощью анализа связывания на основе qPCR (рис.2Б). Чтобы определить, проявляют ли E11 и EV71 также полярность высвобождения, мы инфицировали HIE EV71 или E11 с апикальной или базолатеральной поверхностей, соответственно, и титровали высвободившиеся вирусные частицы потомства из среды, изолированной из апикального или базолатерального компартментов. Эти исследования показали, что E11 высвобождается как из апикального, так и из базолатерального компартментов, хотя его высвобождение смещено в сторону базолатерального компартмента (Fig. 2C). Напротив, EV71 выделялся исключительно из апикального компартмента, и вирусные частицы не были обнаружены в базолатеральном компартменте (рис.2С).

Рис. 2 EV71 преимущественно заражает HIE с апикальной поверхности.

( A ) Репликация E11 и EV71 оценивалась по продукции вРНК с помощью RT-qPCR, когда инфекции были инициированы с апикальной или базолатеральной (базо) поверхностей. Данные представлены как кратное изменение для апикальных инфекций (журнал ₁₀ ). Данные взяты из четырех (E11) или трех (EV71) независимых культур HIE. ( B ) Эффективность связывания EV71 при преадсорбции на апикальную или базолатеральную поверхности по оценке с помощью RT-qPCR.Данные представлены в виде процента апикального связывания и относятся к семи независимым препаратам HIE. ( C ) Репликация E11 и EV71, оцененная титрованием вируса из апикального или базолатерального компартментов, когда инфекция была инициирована с апикальной (EV71) или базолатеральной (E11) поверхностей. Данные взяты из четырех (EV71) или трех (E11) независимых препаратов HIE. LOD, предел обнаружения. nd, ничего не обнаружено. ( D и E ) Кинетика роста NR-меченного EV71 в трех независимых препаратах HIE в указанные моменты времени.Меченый NR EV71 был предварительно адсорбирован на апикальную или базолатеральную поверхности в течение 1 часа в полутемноте и экспонировался на свету при 0 или 6 часах p.i., а затем инфицирование продолжалось в течение указанных часов (от 24 до 96 часов). Инфекцию оценивали по продукции вРНК с помощью RT-qPCR (D) или вирусного титрования (E) из апикального или базолатерального (оранжевый) отсеков. Обратите внимание, что в (E) вирус не был обнаружен в среде, изолированной из базолатерального компартмента. Данные взяты из трех независимых препаратов (от ЛОР-1 до ЛОР-3, серого цвета).Среднее значение показано красным. В (A) — (C) данные представлены как средние значения ± стандартное отклонение (* P <0,05, ** P <0,01, *** P <0,001), причем каждый независимый препарат показан отдельно. символ усреднен из технических копий. Значимость определялась с использованием непарного теста t в пунктах (A) — (C). В пунктах (A) — (C) каждый независимый препарат показан в виде отдельного символа, усредненного по техническим повторениям.

Затем мы выполнили кривые роста HIE, инфицированных EV71, либо с апикальной, либо с базолатеральной поверхностей.Для этих исследований мы использовали нейтральный красный (NR), содержащий частицы EV71, чтобы отличить частицы EV71, которые остались прикрепленными к поверхности клетки, от тех, которые активно реплицировались. Этот метод включает мечение вРНК с помощью NR, соединения, которое перекрестно связывает вРНК при воздействии света ( 19 , 20 ), таким образом генерируя вирусные частицы, которые становятся неинфекционными при воздействии света. Для построения кривых роста мы предварительно адсорбировали NR-EV71 в клетки с апикальной или базолатеральной поверхностей в полутемных условиях, подвергали воздействию света сразу после связывания (0 часов) или после проникновения вируса и высвобождения генома (6 часов с.i.), а затем инфицировали еще от 24 до 96 часов. Таким образом, частицы NR-EV71, оставшиеся на поверхности клетки, станут неинфекционными при 6-часовом воздействии света. Используя HIE, приготовленные из трех независимых тканей человека и инфицированные, как описано, мы обнаружили, что продукция вРНК EV71 достигает пика примерно через 24 часа p.i. а затем быстро снизился на 48-72 часа p.i., при этом уровни значительно снизились на 96 часов p.i. (Рис. 2D). Эта тенденция была характерна для апикальной инфекции, поскольку только один препарат показал какую-либо детектируемую вРНК, когда инфекция была инициирована с базолатеральной поверхности (рис.2D). Параллельно мы собирали клеточные супернатанты из апикального или базолатерального отделов и измеряли высвобождение инфекционных частиц в течение периода от 24 до 96 часов. В соответствии с нашими данными по вРНК, мы обнаружили, что уровни инфекционного высвобождения EV71 были самыми высокими через 24 часа p.i., с уровнями, снижающимися между 48 и 96 часами p.i. (Рис. 2E). Следует отметить, что даже когда низкие уровни инфекционных частиц EV71 высвобождались после инфицирования базолатеральной поверхности, это высвобождение обнаруживалось только в апикальном компартменте (рис.2E). Вместе эти данные показывают, что EV71 проявляет сильное предпочтение инфицировать HIEs с апикальной поверхности и что инфекционные частицы также демонстрируют апикальную полярность высвобождения.

Инфекция ГИЭ EV71 не изменяет барьерную функцию эпителия

Ранее мы показали, что инфекция Е11 энтероидов человека, выращенных в матригеле, вызывала значительное повреждение эпителия, включая реорганизацию плотных контактов ( 16 ). В соответствии с этим мы обнаружили, что инфицирование HIE E11 с базолатеральной поверхности вызывает значительную потерю функции эпителиального барьера, на что указывает потеря значений TER с ~ 2000 до ~ 200 Ом (рис.3А). Напротив, инфекция EV71 (либо с апикальной, либо с базолатеральной поверхностей) не влияла на значения TER (фиг. 3A), даже когда инфекция продолжалась до 4 дней (фиг. 3B). Сходным образом мы обнаружили, что E11 и EV71 также обнаруживают различия в их влиянии на морфологию эпителия, при этом инфекция E11 вызывает потерю целостности актинового цитоскелета, которая не присутствует в инфицированном EV71 HIE (Fig. 3C). Эти данные подчеркивают различия между энтеровирусами по их влиянию на структуру и функцию кишечного эпителия и показывают, что инфекция EV71 не изменяет функцию эпителиального барьера.

Рис. 3 Инфекция EV71 не вызывает потери целостности эпителиального барьера.

( A ) значения TER в указанные дни после покрытия крипт во вставках Transwell. Через 6 дней после посева Transwells инфицировали E11 или EV71 с апикальной или базолатеральной поверхности (красная стрелка), и значения TER измеряли через 24 часа p.i. Данные взяты из одного препарата ГИЭ, выполненного в трех экземплярах, и являются репрезентативными по крайней мере для пяти независимых препаратов. ( B ) Значения TER в указанные дни после заражения EV71 с апикальной или базолатеральной поверхностей.Данные взяты из трех препаратов ГИЭ, выполненных в двух экземплярах. ( C ) Конфокальная микроскопия для vRNA (зеленый) или актина (красный) в ложно инфицированном HIE или HIE, инфицированном E11 с базолатеральной поверхности или EV71 с апикальной поверхности. Изображения были сняты 24 часа в сутки. Увеличенные изображения из белых квадратов, показанных справа. В (A) и (B) данные показаны как средние значения ± стандартное отклонение. Достоверность определяли с использованием двустороннего дисперсионного анализа (ANOVA), *** P <0,001.

EV71 заражает бокаловидные клетки

Поскольку мы наблюдали различия во влиянии инфекций E11 и EV71 на функцию эпителиального барьера, мы затем определили, проявляют ли эти вирусы различия в конкретных типах клеток, инфицированных при ГИЭ.Ранее мы показали, что E11 преимущественно инфицирует энтероциты, а также может инфицировать энтероэндокринные клетки, но не может инфицировать бокаловидные клетки ( 16 ). Чтобы определить, проявляет ли EV71 также специфичность клеточного типа, мы сначала провели иммунофлуоресцентную микроскопию для двухцепочечной vRNA (промежуточного звена репликации) и кодируемого вирусом капсидного белка VP1 в HIE, инфицированном EV71 с апикальной поверхности в течение 24 часов (время, когда мы наблюдаемые пиковые уровни репликации). Эти исследования выявили совместную локализацию вРНК EV71 и VP1 для пунктирования структур в выбранных клетках по всему монослою (рис.4А). Клетки, которые были положительными в отношении вРНК EV71 и VP1, проявляли характеристики бокаловидных клеток, такие как сильно поляризованная ядерная локализация и большое цитоплазматическое пространство (фиг. 4A, увеличенная панель справа). Последующие исследования подтвердили, что вРНК EV71 была локализована исключительно в MUC2-положительных бокаловидных клетках (рис. 4, B и C). В качестве дополнительного подтверждения специфичности инфекции EV71 к бокаловидным клеткам мы также выполнили иммунофлуоресцентную микроскопию для VP1 с использованием метода иммуноокрашивания, который позволяет различать VP1, локализованный на внеклеточной поверхности, и VP1, локализованный внутриклеточно ( 21 ).Эти исследования подтвердили присутствие внутриклеточного VP1 только в клетках, демонстрирующих морфологию бокаловидных клеток (рис. 4D). Следует отметить, что первичный рецептор для EV71, SCARB2 ( 11 ), экспрессировался в бокаловидных клетках, где он локализовался во внутриклеточных пузырьках (рис. S2A). Кроме того, мы обнаружили, что инфицирование HIE EV71 ингибируется обработкой монослоев диназором, ингибитором динамина, что согласуется с ролью клатрин- и SCARB2-зависимого проникновения EV71 в культивируемые клетки (рис.S2B) ( 22 ). В качестве дополнительной поддержки инфекции EV71 бокаловидных клеток мы также обнаружили, что инфицирование EV71 HIE привело к значительному снижению экспрессии муцинов MUC1 и MUC2, экспрессируемых бокаловыми клетками, но не оказало влияния на экспрессию обогащенного энтероцитами фактора транскрипции CDX2. , согласно оценке с помощью RT-qPCR, предполагая, что инфекция может изменять аспекты функции бокаловидных клеток (рис. 4E). В совокупности эти исследования показывают, что EV71 специфически инфицирует через апикальную поверхность HIE и проявляет преимущественное инфицирование бокаловидных клеток.

Рис. 4 EV71 заражает бокаловидные клетки.

( A ) Конфокальные микрофотографии ложного или апикально инфицированного EV71 HIE, иммуноокрашенного на вРНК (зеленый) и VP1 (красный) через 24 часа p.i. Справа показаны увеличенные изображения из областей в белых полях. ( B ) Конфокальные микрофотографии ложного или апикально инфицированного EV71 HIE, иммуноокрашенного на вРНК (зеленый) и MUC2 (красный) через 24 часа p.i. Внизу показаны увеличенные изображения из областей в белых полях. ( C ) Количественная оценка степени совместной локализации между вРНК и MUC2-положительными или MUC2-отрицательными клетками, как оценивали с помощью анализа изображений.Данные были получены из трех независимых препаратов HIE, по крайней мере, из пяти независимых полей. Значимость определялась с использованием непарного теста t , *** P <0,001. ( D ) Конфокальные микрофотографии ложного или апикально инфицированного EV71 HIE, иммуноокрашенного на внутриклеточный (VP1 ^в ; зеленый) или внеклеточный (VP1 ^из ; красный) через 24 часа p.i. Справа показаны увеличенные изображения из областей в белых пунктирных прямоугольниках. ( E ) Экспрессия MUC1, MUC2 и CDX2 по оценке с помощью RT-qPCR в указанные моменты времени после заражения (с апикальной поверхности).Монослои инфицировали NR-меченным EV71, экспонированным на свету сразу после адсорбции (0 часов) или через 6 часов p.i., а затем заражению позволяли продолжаться в течение указанного времени (в часах). Данные показаны как кратное изменение от HIE, подвергнутого воздействию света в 0 часов, и относятся к трем или четырем независимым препаратам HIE. Достоверность определяли с использованием однофакторного дисперсионного анализа с тестом Даннета для множественных сравнений (по сравнению с 0-часовыми контролями) в ** P <0,01. В (C) и (E) данные показаны как средние значения ± стандартное отклонение.В (E) независимые препараты показаны в виде отдельного символа, усредненного по техническим репликам.

IFN типа III индуцируются в ответ на инфицирование HIE EV71

Наши исследования кривой роста EV71 показали, что пик репликации EV71 приходился на 24 часа пи, а уровни инфекции снижались после этого момента времени (рис. 2, D и E). Эти данные предполагают, что врожденный иммунный ответ хозяина на EV71 может подавлять репликацию вируса на ранней стадии, чтобы контролировать его репликацию.Чтобы определить, так ли это, мы выполнили анализ RT-qPCR для двух ISG, которые, как мы ранее показали, были индуцированы в HIE в ответ на инфекцию E11 ( 16 ) в HIE, инфицированном EV71. Эти исследования показали, что эти ISG, CXCL10 и IFI44L, были индуцированы инфекцией HIE EV71 через 24 часа p.i., с уменьшением индукции на 48-72 часа p.i. (Рис. 5A). Точно так же мы обнаружили, что инфекция EV71 и E11 сильно индуцировала экспрессию ISG IFIT1, как было оценено с помощью конфокальной микроскопии, с повышенными уровнями IFIT1, наблюдаемыми в инфицированных клетках (рис.5Б).

Рис. 5 Инфекция HIE, вызванная вирусом EV71, индуцирует интерфероны III типа.

( A ) RT-qPCR для двух ISG, CXCL10 и IFI44L в HIE, инфицированном NR-меченным EV71 с апикальной поверхности в течение указанного времени. Данные получены для трех независимых препаратов HIE и показаны как кратное изменение (log ₁₀ ) для культур, подвергнутых воздействию света через 0 часов. * P <0,05, ** P <0,01. ( B ) Конфокальные микрофотографии ISG IFIT1 (красный цвет) в культурах HIE, инфицированных EV71 с апикальной части или E11 с базолатеральной поверхности в течение 24 часов.вРНК показана зеленым цветом, а ядра, окрашенные DAPI, — синим. Белые стрелки на средней панели обозначают вРНК-положительные клетки EV71. Справа на средней панели белое поле обозначает EV71-положительную ячейку и показано на увеличенном изображении в правом верхнем углу. ( C ) Luminex анализирует IFN-β, IFN-λ1 или IFN-λ2 / 3 от HIE, инфицированного EV71 с апикальной поверхности в течение 24 или 48 часов. Данные представлены в пикограммах на миллилитр и относятся к четырем независимым препаратам ГИЭ. Данные в (A) и (C) показаны как средние значения ± стандартное отклонение с независимыми препаратами, показанными в виде отдельного символа, усредненного по техническим репликам (A).Достоверность определялась с использованием теста Краскела-Уоллиса с тестом Данна для множественных сравнений. В (A) и (C) каждый независимый препарат показан в виде отдельного символа, усредненного по техническим репликам.

Затем мы определили, являются ли IFN типа I и / или типа III ответственными за эту индукцию ISG, выполнив одноплексные анализы Luminex для IFN-β, IFN-λ1 или IFN-λ2 / 3 (высокая степень гомологии последовательностей между ними IFNs делают их неотличимыми в этом анализе). Мы обнаружили, что инфицирование HIE EV71 привело к специфической индукции IFN типа III, в частности IFN-λ2 / 3, как через 24, так и через 48 часов.i., без детектируемого индуцированного IFN-λ1 и индуцированного очень низкого уровня IFN-β через 24 часа (фиг. 5C). Следует отметить, что IFN присутствовали в среде, собранной из апикальной камеры после инфекции, и мы не смогли обнаружить какие-либо IFN из среды, взятой из базолатеральной камеры. Аналогичным образом, инфекция E11 также индуцировала преимущественную секрецию IFN типа III, но, в отличие от EV71, низкие уровни IFN-λ1 также вырабатывались в ответ на инфекцию (фиг. S3A). Эти данные предполагают, что IFN типа III, в частности IFN-λ2 / 3, индуцируются в ответ на инфекцию HIE EV71.

EV71 является сенсибилизированным к противовирусным эффектам IFN типа III.

Поскольку E11 и EV71 оба индуцировали IFN типа III в инфицированном HIE, мы затем определили, были ли эти вирусы чувствительны к противовирусным эффектам IFN типа I и III в вирусных инфекциях. или IFN-специфическим способом. HIE предварительно обрабатывали рекомбинантным IFN-β или IFN-λ (IFN-λ3, который индуцировался как E11, так и EV71) в течение 24 часов, а затем инфицировали E11 или EV71 с базолатеральной или апикальной поверхностей соответственно. Мы обнаружили, что, в то время как E11 более сильно ограничивался обработкой IFN-β, как было обнаружено с помощью RT-qPCR для вРНК и вирусного титрования, EV71 более сильно ограничивался обработкой IFN-λ (рис.6, А и Б). Затем мы определили, проявляют ли HIE различия в их способности отвечать на экзогенные IFN типа I и III и индуцируют ли эти IFN ISG с различной кинетикой, как это было показано у взрослых энтероидов в ранние моменты времени воздействия ( 23 ), что можно объяснить дифференциальное управление E11 и EV71. Для этого мы сначала выполнили профили транскрипции RNA-seq из HIE, обработанных рекомбинантным IFN-β или IFN-λ в течение 24 часов. Анализ дифференциальной экспрессии показал, что ГИЭ, полученная из плода, активно реагирует на IFN-β и IFN-λ и индуцирует экспрессию канонических ISG на аналогичных уровнях (рис.6, В и Г). Более того, анализ дифференциальной экспрессии между HIE, обработанной IFN-β- и IFN-λ, показал, что очень немногие транскрипты дифференциально регулируются IFN-β, при этом ни один из этих транскриптов не является известным ISG (рис. S3B). Кинетическое профилирование чувствительности HIE к рекомбинантным IFN-β и IFN-λ подтвердило эти данные и показало, что не было значительных различий в кинетике ответа HIE плода на лечение IFN I или III типа (рис. S4). В совокупности эти данные показывают, что энтеровирусы проявляют дифференциальную чувствительность к противовирусным эффектам IFN, при этом EV71 проявляет повышенную чувствительность к IFN типа III.

Фиг. 6 EV71 подавляется обработкой HIE рекомбинантным IFN типа III.

( A и B ) Инфекция E11 и EV71 от HIE, предварительно обработанная 500 нг IFN-β или IFN-λ3 в течение 24 часов, а затем инфицированная E11 или EV71 в течение 24 часов. В (A) репликацию оценивали по продукции вРНК с помощью RT-qPCR, а в (B) выполняли титрование вирусов с помощью анализа бляшек. В (A) и (B) данные показаны как средние значения ± стандартное отклонение. ( C и D ) Графики вулканов HIE, обработанные 500 нг IFN-β (C) или IFN-λ1 (D), обозначающие ISG (красные кружки) или не-ISG (желтый кружок), дифференциально выраженные обработкой ( P <0.05). Серые круги - гены, дифференциальная экспрессия которых не была значимой. Данные взяты из трех независимых препаратов HIE. Односторонний дисперсионный анализ с тестом Даннета для множественных сравнений был использован для определения значимости в (A) и (B). В (A) и (B) каждый независимый препарат показан в виде отдельного символа, усредненного из технических копий. ( E ) ГИЭ обрабатывали ингибитором JAK1 / 2 руксолитинибом (5 мкМ) [или диметилсульфоксидом (ДМСО) в качестве контроля] в течение 1 часа, а затем инфицировали EV71 в течение 24 часов в присутствии руксолитиниба (или ДМСО в качестве контроля. ).В это время была выделена РНК, и была проведена RT-qPCR для ISG CXCL10, IFI44L и OASL. Показана индукция складки из HIE, обработанной ДМСО. ( F ) HIE обрабатывали руксолитинибом (5 мкМ) в течение 1 часа, а затем инфицировали EV71 в течение 48 часов. В это время проводили титрование вирусов со среды, взятой из апикального компартмента. Все данные представлены как средние значения ± стандартное отклонение. Для определения значимости использовался стандартный (E) или парный (F) тест t (* P <0.05, ** P <0,01, *** P <0,001). В (A) и (B), а также (E) и (F) каждый независимый препарат показан как отдельный символ, усредненный по техническим репликам.

IFNs типа III контролируют EV71 в HIE

Поскольку мы обнаружили, что инфицирование EV71 HIE преимущественно индуцировало IFNs типа III и что лечение HIE рекомбинантным IFN-λ-ограниченным инфицированием EV71, мы затем определили, контролируют ли IFN репликацию EV71 в ходе Инфекция HIE.Для этого мы использовали селективный низкомолекулярный ингибитор передачи сигналов JAK1 / 2 (INCB018424 / руксолитиниб). Во-первых, мы подтвердили, что руксолитиниб был активен в HIE и что он ингибировал индукцию ISG ниже передачи сигналов IFN. Мы обнаружили, что обработка HIE 5 мкМ руксолитиниба ингибировала индукцию ISG в четырех независимых препаратах HIE, подвергнутых воздействию 500 нг рекомбинантного IFN-λ (рис. S3C), подтверждая, что этот ингибитор сильно подавлял индуцированную IFN экспрессию ISG при HIE. Затем мы определили, будет ли руксолитиниб ингибировать индуцированную EV71 индукцию ISG и будет ли это лечение сенсибилизировать HIE к инфекции EV71.Мы обнаружили, что лечение ГИЭ руксолитинибом значительно снижает индукцию ISG в инфицированном EV71 HIE (рис. 6E). Мы также обнаружили, что обработка руксолитинибом усиливала репликацию EV71 при ГИЭ со значительным увеличением титров EV71 в ГИЭ, обработанном руксолитинибом (рис. 6F). Эти данные подтверждают роль IFN типа III в контроле инфекции HIE EV71.

ОБСУЖДЕНИЕ

События, связанные с инфекцией EV71 желудочно-кишечного тракта человека, в значительной степени неизвестны. Здесь мы показываем, что EV71 преимущественно инфицирует HIE с апикальной поверхности, где он преимущественно реплицируется в MUC2-положительных бокаловидных клетках.Мы также показываем, что, в отличие от энтеровируса E11, нацеленного на энтероциты, инфицирование HIE EV71 не влияет на функцию эпителиального барьера или морфологию цитоскелета, но инфекция снижает экспрессию муцинов, связанных с бокаловидными клетками, что позволяет предположить, что его репликация может изменить некоторые аспекты функция бокаловидной клетки. Мы также показали, что инфицирование HIE EV71 специфически индуцирует IFN IFN-λ2 / 3 типа III, который служит для ограничения репликации EV71. В совокупности эти результаты обеспечивают важную информацию о механизмах, с помощью которых EV71 и другие энтеровирусы обходят барьер GI, и указывают на важную роль IFN типа III в ответе хозяина на энтеровирусные инфекции в желудочно-кишечном тракте.

Наши данные показывают, что энтеровирусы проявляют специфичность определенного типа клеток, благодаря которой они заражают желудочно-кишечный тракт человека вирус-специфическим образом. В то время как E11 специфически нацелен на энтероциты, а также инфицирует энтероэндокринные клетки ( 16 ), EV71 преимущественно инфицирует бокаловидные клетки. Хотя возможно, что EV71 также реплицируется в других типах клеток, присутствующих в HIE на уровнях, которые ниже предела обнаружения в наших анализах, наши данные указывают на обогащение репликации EV71 в бокаловидных клетках.Механистическая основа дифференцированной специфичности клеточного типа между E11 и EV71 остается неясной, хотя специфическая для клеточного типа экспрессия и локализация вирусных рецепторов, вероятно, играют ключевую роль. Хотя рецептор для E11 неизвестен, все изоляты EV71, протестированные на сегодняшний день, используют SCARB2 в качестве первичного рецептора ( 11 , 24 ). SCARB2, также известный как лизосомный интегральный мембранный белок II, представляет собой интегральный мембранный белок, который специфически локализуется в лизосомах и секреторных гранулах ( 25 ).Мы обнаружили, что SCARB2 экспрессируется в бокаловидных клетках, где он локализуется во внутриклеточных пузырьках. Бокаловидные клетки характеризуются наличием крупных секреторных пузырьков, которые служат для транспортировки слизи к апикальной поверхности эпителия. Таким образом, нацеливание EV71 на бокаловидные клетки для кишечной инфекции, вероятно, обусловлено, по крайней мере, частично, обогащением SCARB2 секреторными пузырьками внутри этих клеток, которые могут обнажать рецептор посредством высвобождения апикальной слизи. Также возможно, что EV71 использует др. Апикально локализованные факторы прикрепления для своего начального связывания с эпителиальной поверхностью, так же как CVB полагается на фактор ускорения распада для прикрепления к апикальной поверхности ( 26 ), прежде чем он достигнет SCARB2.EV71, как было показано, взаимодействует с гликанами, связанными с сиаловой кислотой, что может способствовать его первоначальному прикреплению к апикальной поверхности эпителия ( 27 ). Однако маловероятно, что это связывание является основным фактором, определяющим инфекцию бокаловидных клеток. Характер энтеровирусных инфекций, специфичный для определенного типа клеток, также предполагает, что реакция хозяина на инфекцию может различаться в зависимости от конкретных типов клеток, на которые воздействует данный вирус. В подтверждение этого наши данные также указывают на важные различия во влиянии инфекции E11 и EV71 на структуру эпителия и барьерную функцию, которые могут заметно влиять на вирусный патогенез вирус-специфическим образом.

Наши результаты указывают на то, что ИФН III типа играют ключевую роль в борьбе с энтеровирусными инфекциями в желудочно-кишечном тракте. Эти результаты согласуются с работой других, которые показали, что ротавирусы человека ( 28 — 31 ), реовирусы ( 32 ) и норовирусы ( 32 — 34 ) также контролируются кишечными инфекциями. IFN типа III. Однако, в отличие от других кишечных вирусов, таких как ротавирус, который контролирует выработку IFN типа III во время инфекции посредством вирусного антагонизма ( 28 ), наши результаты показывают, что инфекция E11 и EV71 индуцирует секрецию IFN типа III на уровне белка, что позволяет предположить что энтеровирусы могут не иметь этого механизма или быть менее эффективными в подавлении этого пути.В клеточных линиях, даже в линиях кишечного происхождения, EV71 и другие энтеровирусы сильно противодействуют врожденному иммунному ответу хозяина ( 35 ). Это говорит о том, что механизмы уклонения могут различаться в первичных клетках, особенно тех, которые изолированы из желудочно-кишечного тракта. Наши данные также показывают, что EV71, но не E11, более сильно ограничивается IFN типа III, чем IFN типа I. Подобно E11, ротавирусы также более чувствительны к экзогенной обработке IFN типа I ( 28 ). Механистическая основа этих различий в чувствительности неясна, но наши данные показывают, что, по крайней мере, в желудочно-кишечном тракте плода, эти различия вряд ли являются результатом различий в величине или кинетике индукции ISG между IFN типа I и III.Напротив, эти различия могут быть результатом различий в специфической для типа клеток природе кишечных вирусных инфекций, при этом ротавирусы ( 36 ) и E11 ( 16 ) преимущественно инфицируют энтероциты, тогда как EV71 нацелен на бокаловидные клетки. Однако наше иммунофлуоресцентное окрашивание IFIT1, которое выявило повышенную экспрессию этого ISG в бокаловидных клетках, инфицированных EV71, и в соседних неинфицированных энтероцитах, предполагает, что оба типа клеток отвечают на IFN типа III, индуцированные в ходе инфекции.Будущие исследования, посвященные изучению роли IFN в уникальных типах клеток HIE, дадут важные ключи к разгадке дифференциальной роли, которую IFN I и III типов могут играть в желудочно-кишечном тракте.

Наши исследования показывают, что энтеровирусы развили различные механизмы для инфицирования различных типов клеток в эпителии GI, что может влиять на многие аспекты их патогенеза, включая роль, которую IFNs типа III играют в ограничении инфекции и распространения. Дальнейшее определение событий, связанных с инфекцией EV71 в желудочно-кишечном тракте, может привести к идентификации новых терапевтических мишеней и / или стратегий предотвращения или лечения патогенеза и заболеваемости, связанных с инфекциями, вызванными этим вирусом.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Культура клеток и выделение крипт человека

Крипты кишечника плода человека выделяли из всего тонкого кишечника и культивировали, как описано ранее ( 16 ). Ткань человеческого плода (<24 недель беременности), полученная в результате выборочного прерывания беременности, была получена от Питтсбургского университета для биопрепаратов через систему честных брокеров после одобрения Институционального наблюдательного совета Питтсбургского университета и в соответствии с закупками анатомических тканей Питтсбургского университета. руководящие указания.Все ткани были генетически нормальными. Приблизительно 100 изолированных крипт помещали в каждую лунку 24-луночной T-clear (размер пор 0,4 мкм) вставки Transwell и выращивали в среде для культивирования крипт, состоящей из Advanced DMEM / F12 (Invitrogen) с 20% HyClone ES (эмбриональный стебель). Клеточная фетальная бычья сыворотка (Thermo Fisher Scientific), 1% пенициллин / стрептомицин (Invitrogen), 1% l-глутамин, гентамицин, 0,2% амфотерицин B, 1% N -ацетилцистеин (100 мМ; Sigma-Aldrich), 1% добавка N-2 (100 ×; Invitrogen), 2% добавка B27 (50 ×; Invitrogen), Gibco Hepes ( N -2-гидроксиэтилпиперазин- N -2-этансульфоновая кислота, 0.05 мМ; Invitrogen), ингибитор ROCK Y-27632 (1 мМ, 100 ×; Sigma) и с добавлением следующих факторов роста: WNT3a (100 нг / мл; Thermo Fisher Scientific), R-спондин (500 нг / мл; R&D Systems), Noggin (100 нг / мл; PeproTech) и EGF (50 нг / мл; Thermo Fisher Scientific) ( 37 , 38 ) на оставшуюся часть соответствующих экспериментов, со сменой среды каждые 48 часов. Если не указано иное, монослои HIE использовали в исследованиях через 6 дней после нанесения покрытия и когда значения TER были> 600 Ом.

Вирусные инфекции

Эксперименты проводились с EV71 (1095) или E11 (Грегори), которые были расширены, как описано ранее ( 39 ). В некоторых случаях эксперименты проводились со светочувствительными вирусными частицами NR, которые были получены, как описано ранее ( 21 ). Вкратце, EV71 размножали в присутствии NR (10 мкг / мл) в полутемноте и затем очищали в полутемных условиях ультрацентрифугированием на сахарозной подушке, как описано ( 39 ).

Для инфекций лунки инфицировали 10 ⁶ бляшкообразующих единиц (БОЕ) указанного вируса. Вирус был преадсорбирован на апикальную или базолатеральную поверхности в течение 1 часа при комнатной температуре (базолатеральные инфекции были инициированы переворачиванием вставок Transwell). Затем заражение инициировалось повышением температуры до 37 ° C и продолжалось в течение указанного времени. Для экспериментов с вирусом NR частицы подвергали воздействию света (на световом ящике) в течение 20 минут при 6 часах p.i. а затем инфицировали в течение указанного количества часов после воздействия света.В некоторых случаях клетки подвергались воздействию сразу после адсорбции (0 часов), которая служила контролем. Анализы бляшек E11 и EV71 проводили в клетках HeLa, покрытых 1,0 или 0,8% агарозы, соответственно; бляшки подсчитывали после окрашивания кристаллическим фиолетовым.

Анализы связывания выполняли путем предварительной адсорбции 10 ⁶ БОЕ указанного вируса на апикальные или базолатеральные поверхности в течение 60 минут при комнатной температуре с последующей обширной промывкой 1 × фосфатно-солевым буфером (PBS).После промывки сразу же выделяли РНК и проводили ОТ-КПЦР, как описано ниже.

КПЦР и синтез комплементарной ДНК

Тотальную РНК получали из HIE с использованием набора Sigma GenElute Total Mammalian RNA Miniprep Kit в соответствии с протоколом производителя и с использованием дополнительного переваривающего реагента Sigma DNase. РНК подвергали обратной транскрипции с помощью набора для синтеза кДНК iScript (Bio-Rad) в соответствии с инструкциями производителя. Один микрограмм общей РНК подвергали обратной транскрипции в 20 мкл реакции и затем разбавляли до 100 мкл для использования.RT-qPCR выполняли с использованием iQ SYBR Green Supermix или iTaq Universal SYBR Green Supermix (Bio-Rad) на системе обнаружения ПЦР в реальном времени CFX96 Touch (Bio-Rad). Экспрессию генов определяли на основе метода Δ C _Q , нормированного на человеческий актин. Последовательности праймеров можно найти в таблице S1.

Секвенирование РНК

Тотальную РНК экстрагировали, как описано выше. Качество РНК оценивали с помощью NanoDrop и биоанализатора Agilent, и 1 мкг использовали для подготовки библиотеки с использованием набора TruSeq Stranded mRNA Library Preparation Kit (Illumina) в соответствии с инструкциями производителя.Секвенирование выполняли на Illumina NextSeq 500. Данные RNA-seq FASTQ были обработаны и сопоставлены с эталонным геномом человека (hg38) с использованием CLC Genomics Workbench 11 (Qiagen). Дифференциальную экспрессию генов выполняли с использованием пакета DESeq2 в R ( 18 ). Файлы из HIE, использованные в данном исследовании, были помещены в архивы последовательного чтения.

Иммунофлуоресцентная микроскопия

Монослои, выращенные на вставках Transwell, промывали PBS и фиксировали 4% параформальдегидом при комнатной температуре, затем 0.25% Triton X-100 для проницаемости клеточных мембран в течение минимум 15 минут при комнатной температуре. Культуры инкубировали с первичными антителами в течение 1 часа при комнатной температуре, промывали, а затем инкубировали в течение 30 минут при комнатной температуре с вторичными антителами, конъюгированными с Alexa Fluor (Invitrogen). Предметные стекла промывали и устанавливали с помощью Vectashield (Vector Laboratories), содержащего 4 ‘, 6-диамидино-2-фенилиндол (DAPI). Были использованы следующие антитела или реагенты: рекомбинантное антитело против двухцепочечной РНК (дцРНК) [предоставлено A.Brass, University of Massachusetts и описанный ранее ( 40 )], MUC2 (H-300, Santa Cruz Biotechnology), лизоцим C (E-5, Santa Cruz Biotechnology), E-кадгерин (ECCD-2, Invitrogen), ZO -1 (ZMD.436, Invitrogen), цитокератин-19 (EP1580Y, Abcam), VP1 (NCL-ENTERO, Leica), IFIT1 (PA3-848, Thermo Fisher Scientific), кишечный ALPL (ab186422, Abcam) и SCARB2 ( EPR12081, Abcam) и фаллоидин, конъюгированный с Alexa Fluor 594– или Alexa Fluor 633 (Invitrogen). Изображения были получены с использованием инвертированного лазерного сканирующего конфокального микроскопа Zeiss LSM 710 или тандемного сканирующего конфокального микроскопа Leica SP8X с лазером белого света и с регулировкой контраста в Photoshop.Анализ изображений проводился с использованием Фиджи. MUC2- и VP1-положительные клетки подсчитывали с помощью плагина ImageJ Cell Counter.

Обработка рекомбинантным IFN

Монослои HIE обрабатывали 100-500 нг рекомбинантного IFN-β, IFN-λ1 или IFN-λ3 (1598-IL-025, 5259-IL-025 и 8499-IF-010; R&D Systems) добавляли как в апикальный, так и в базолатеральный компартменты за ~ 20 часов до инициации инфекции, как описано выше.

Обработки ингибиторами

Монослои HIE обрабатывали 5 мкМ руксолитиниба или диметилсульфоксида (ДМСО) контролем в течение 1 часа при 37 ° C, а затем инфицировали меченным NR EV71 или обрабатывали IFN-λ3 в присутствии руксолитиниба или ДМСО.Точно так же монослои HIE обрабатывали 80 мкМ dynasore или DMSO в течение 30 мин при 37 ° C перед заражением NR-меченным EV71 в присутствии dynasore или DMSO.

Luminex assays

Профилирование Luminex было выполнено с использованием наборов IFN-β, интерлейкина-29 (IL-29) и IL-28A (Bio-Rad) Human Bio-Plex Pro Inflampting Panel 1 в соответствии с протоколом производителя с использованием лабораторная мультианалитическая система профилирования (LabMAP), разработанная Luminex Corporation (Остин, Техас).

Статистика

Весь статистический анализ проводился с использованием GraphPad Prism.Эксперименты проводились не менее трех раз из независимых кишечников с техническими повторениями, выполненными из независимых Transwells (всего в этом исследовании использовалось 36 тонких кишечников), как указано в подписях к рисункам или как подробно описано здесь в тексте. Данные представлены как средние значения ± стандартное отклонение. Тест Стьюдента t , односторонний дисперсионный анализ (ANOVA) или двусторонний дисперсионный анализ ANOVA использовали для определения статистической значимости, как описано в подписях к рисункам. Параметрические тесты применялись при нормальном распределении данных на основе анализа Д’Агостино-Пирсона.Если данные не распределялись нормально (на основе анализа Д’Агостино-Пирсона), применялись непараметрические тесты. Значения P <0,05 считались статистически значимыми, при этом конкретные значения P отмечены в подписях к рисункам.

ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

Дополнительные материалы к этой статье доступны по адресу http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/5/3/eaau4255/DC1

Рис. S1. Валидация и модель монослоев кишечного эпителия человека.

Рис. S2. Локализация SCARB2 при ГИЭ и динамин-зависимая инфекция ГИЭ EV71.

Рис. S3. Индукция IFN и передача сигналов при ГИЭ.

Рис. S4. Кинетика индукции ISG при ГИЭ, обработанном рекомбинантными ИФН.

Таблица S1. Праймеры, использованные в этом исследовании.

Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями некоммерческой лицензии Creative Commons Attribution, которая разрешает использование, распространение и воспроизведение на любом носителе, при условии, что конечным результатом будет использование , а не для коммерческих целей и при условии, что оригинальная работа правильно процитирована.

Благодарности: Мы благодарим К. МакХью (Детская больница Питтсбурга) за помощь с тестами Luminex, У. Хорна (Детская больница Питтсбурга) за помощь с RNA-seq, А. Брасса (Университет Массачусетса) за предоставление антибиотиков. -dsRNA антитела и C. Drummond (Университет Питтсбурга) за техническую помощь. Финансирование: Этот проект был поддержан NIH R01-AI081759 (для C.B.C.), премией Burroughs Wellcome Investigators in the Pathogenesis of Infectious Disease Award (C.B.C.) и детской больнице Питтсбурга системы здравоохранения UPMC (C.B.C.). В этом проекте также использовались ресурсы UPMC Hillman Cancer Center и Tissue and Research Pathology / Pitt Biospecimen Core, которые частично поддерживаются наградой P30CA047904. Вклад авторов: C.G., A.I.W. и C.B.C. задумал и спланировал эксперименты. К.Г. и A.I.W. проводил эксперименты. C.G., A.I.W. и C.B.C. проанализировали данные. C.G., A.I.W. и C.B.C. способствовал написанию рукописи. Конкурирующие интересы: Все авторы заявляют, что у них нет конкурирующих интересов. Материалы и наличие данных: Все данные, необходимые для оценки выводов в статье, представлены в документе и / или дополнительных материалах. Дополнительные данные, относящиеся к этой статье, могут быть запрошены у авторов.

• Copyright © 2019 Авторы, некоторые права защищены; эксклюзивный лицензиат Американской ассоциации содействия развитию науки. Нет претензий к оригиналу США.Правительственные работы. Распространяется по некоммерческой лицензии Creative Commons Attribution 4.0 (CC BY-NC).

Диабет 1 типа связан с энтеровирусной инфекцией слизистой оболочки кишечника

Abstract

Энтеровирусные инфекции были связаны с диабетом 1 типа в нескольких исследованиях. Энтеровирусы также обладают тропизмом к островкам поджелудочной железы и могут вызывать повреждение β-клеток в экспериментальных моделях. Считается, что персистентность вируса является важным патогенетическим фактором. В этом исследовании оценивается, является ли слизистая оболочка кишечника резервуаром персистенции энтеровируса у пациентов с диабетом 1 типа.Образцы биопсии слизистой оболочки тонкой кишки от 39 пациентов с диабетом типа 1, 41 контрольного субъекта и 40 пациентов с глютеновой болезнью были проанализированы на наличие энтеровируса с использованием гибридизации in situ (ISH), RT-PCR и иммуногистохимии. Присутствие вируса сравнивали с воспалительными маркерами, такими как инфильтрирующие Т-клетки, экспрессия HLA-DR и нацеленные на трансглутаминазу 2 отложения IgA. РНК энтеровируса обнаруживалась у пациентов с диабетом чаще, чем у контрольных субъектов, и была связана с явным воспалительным ответом в слизистой оболочке кишечника.Вирусная РНК часто обнаруживалась в отсутствие вирусного белка, что свидетельствует о дефектной репликации вируса. Пациенты оставались вирусоположительными в контрольных образцах, взятых после 12 месяцев наблюдения. Результаты показывают, что большая часть пациентов с диабетом 1 типа имеет длительную / стойкую энтеровирусную инфекцию, связанную с воспалительным процессом в слизистой оболочке кишечника. Это открытие открывает новые возможности для изучения вирусной этиологии диабета 1 типа.

Диабет 1 типа — одно из наиболее распространенных хронических заболеваний в развитых странах, и его заболеваемость резко возросла после Второй мировой войны.Это вызвано избирательным разрушением инсулин-продуцирующих β-клеток поджелудочной железы, опосредованным иммунологическими механизмами. Восприимчивость к заболеванию модулируется более чем 40 различными генами риска, при этом гены HLA вносят более половины генетической предрасположенности. Факторы окружающей среды явно влияют на риск заболевания и способствуют быстрому росту заболеваемости.

Связь между диабетом 1 типа и энтеровирусными инфекциями широко изучена. Энтеровирусы были обнаружены в крови и поджелудочной железе у пациентов с диабетом 1 типа в нескольких исследованиях, а в проспективных исследованиях они также были связаны с повышенным риском диабета 1 типа (1–7).Недавнее открытие генетических полиморфизмов гена IFIh2 как факторов, модулирующих риск диабета, еще больше усилило эту ассоциацию, поскольку эти гены опосредуют распознавание энтеровирусов системой врожденного иммунитета (8,9). Полиморфизм, связанный с диабетом, по-видимому, связан с сильным врожденным иммунным ответом, который может привести к усилению воспалительного ответа во время вирусной инфекции (10). Другие гены врожденной иммунной системы (сеть IRF7 ) также модулируют риск СД1 (11).

Частое обнаружение вируса у пациентов с диабетом предполагает возможную роль персистенции вируса. Персистенция энтеровирусов была ранее описана, например, при хронических кардиомиопатиях (12) и на животных моделях (13–16), где энтеровирусы и другие пикорнавирусы могут сохраняться в течение длительных периодов времени. Эти исследования показали, что энтеровирус может существовать как двухцепочечная РНК без четкого синтеза белка (15,17). Из нескольких вирусных заболеваний известно, что стойкая инфекция обычно приводит к сильному врожденному иммунному ответу, местному воспалению и иммуноопосредованному повреждению тканей.

Целиакия характеризуется воспалением тонкого кишечника, повреждением слизистой оболочки и повышенной проницаемостью слизистой оболочки. Связь между диабетом 1 типа и целиакией хорошо известна. Поэтому интересно предположить, способствуют ли энтеровирусная инфекция и энтеропатия этой ассоциации.

Несмотря на недавний прогресс в этой области исследований, неизвестно, каким образом энтеровирусы могут вызывать избирательное повреждение инсулин-продуцирующих β-клеток. Их первичный сайт репликации — слизистая оболочка кишечника, из которой вирус может распространяться в кровь (первичная виремия) и инфицировать внутренние органы.Однако возможное присутствие энтеровирусов в кишечнике человека подробно не изучалось. Недавно мы опубликовали первое такое исследование, предполагающее, что энтеровирус может присутствовать в тонком кишечнике у пациентов с диабетом 1 типа (18). Настоящее исследование оценивает гипотезу о том, что слизистая оболочка кишечника является резервуаром для персистенции энтеровируса у пациентов с диабетом 1 типа, поддерживая непрерывное воспалительное состояние, которое может распространяться на поджелудочную железу и играть решающую роль в диабете, вызванном энтеровирусом.

ДИЗАЙН И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Серия исследований.

В серию исследований вошли 120 человек, которым была сделана гастроскопия из-за различных заболеваний желудочно-кишечного тракта. Биопсии слизистой оболочки тонкой кишки были взяты из дистального отдела двенадцатиперстной кишки для морфологического анализа и фундаментальных исследований. Образцы были взяты в период 1995–2000 гг. В отделении гастроэнтерологии университетской больницы Тампере. Образцы, фиксированные формалином, были доступны у всех 120 участников исследования, а замороженные образцы — у 86 человек.

Объектами исследования были 39 пациентов с диабетом 1 типа, 40 пациентов с глютеновой болезнью, у которых не было диабета 1 типа, и 41 субъект контрольной группы, включая субъектов, у которых не было ни одного из этих заболеваний, но были неспецифические желудочно-кишечные симптомы (25 диспепсия, 10 синдром раздраженного кишечника). , 3 афтозных стоматита, 1 язвенный колит, 1 коллагенозный колит и 1 в конечном итоге здоровый). Кроме того, у одного контрольного субъекта был псориаз и одна IgA-нефропатия. Все контрольные субъекты не страдали диабетом и не демонстрировали признаков целиакии (таблица 1).

ТАБЛИЦА 1

Краткое изложение субъектов исследования

Диагноз диабета 1 типа был основан на критериях Всемирной организации здравоохранения (19), и все пациенты получали лечение инсулином. Шестнадцать также страдали глютеновой болезнью, 10 — аутоиммунным заболеванием щитовидной железы, 1 — нефропатией IgA, 1 — болезнью Аддисона, 1 — алопецией и 1 — ревматоидным артритом. Продолжительность диабета варьировала от 0 до 38 лет (в среднем 20 лет; точная информация доступна только от 23 пациентов).

Глютеновая болезнь была диагностирована у субъектов исследования по положительному результату на эндомизиальные антитела, а также по атрофии ворсинок слизистой тонкой кишки и гиперплазии крипт.У всех пациентов недавно была диагностирована глютеновая болезнь, и все они на момент проведения биопсии соблюдали нормальную глютеновую диету. У одного пациента с глютеновой болезнью была IgA-нефропатия, а у одного — гипертиреоз.

Протокол исследования был одобрен этическим комитетом университетской больницы Тампере. Все субъекты дали информированное согласие.

Гибридизация in situ.

Первичный скрининг энтеровируса проводился на фиксированных формалином и залитых парафином образцах биопсии (срезы размером 5 мкм) с использованием анализа гибридизации in situ (ISH), как описано ранее (4,18,20).Это основано на использовании одного специфичного для энтеровируса зонда, нацеленного на высококонсервативную, общую для группы последовательность в 5′-некодирующей области генома энтеровируса. Этот анализ охватывает большинство, если не все известные типы энтеровирусов. Все анализы проводились без учета статуса «случай-контроль» субъектов. Положительный сигнал гибридизации определяли полуколичественно путем подсчета положительных клеток в поле микроскопа по следующим категориям: отрицательные (нет положительных клеток), слабоположительные (в среднем 1–10 положительных клеток на поле микроскопа при 400-кратном увеличении), умеренно положительные (10–10). 100 положительных клеток на поле) и сильные положительные (> 100 клеток на поле).

Иммуногистохимическое окрашивание.

Фиксированные формалином образцы биопсии, залитые парафином (срезы размером 5 мкм), окрашивали антиэнтеровирусным антителом VP1 (клон 5-D8 / 1, 1: 300; DakoCytomation, Glostrup, Дания) с использованием Ventana BencMark LT (Ventana Medical Systems) и система обнаружения ultra View Universal, как описано ранее (20). Известные вирус-положительные образцы тканей и клеточных культур использовали для подтверждения надежности окрашивания всех отдельных партий окрашивания. CD3 ⁺ интраэпителиальных лимфоцитов (IEL) окрашивали моноклональным антителом Leu-4 (Becton Dickinson, Сан-Хосе, Калифорния), IEL αβ ⁺ с моноклональным антителом βF1 (Endogen, Woburn, MA) и γδ ⁺ s с антителом к ​​Т-клеточному рецептору γ (Endogen).Положительные IEL подсчитывались с объективом × 100 по всему поверхностному эпителию, а контрольные значения IEL были установлены на 37 клеток / мм для CD3 ⁺ , 25 для αβ ⁺ и 4,3 для γδ ⁺ IEL, как описано ранее ( 21). Экспрессию HLA-DR слизистой оболочки определяли с помощью моноклональных антител к HLA-DR (Becton Dickinson) и оценивали, как описано ранее (22). Отложения IgA анализировали из незафиксированных замороженных срезов с использованием двойного окрашивания кроличьим антителом против человеческого IgA (Dako, Glostrup, Дания), меченным флуоресцеинизотиоцианатом, и моноклональным мышиным антителом против трансглутаминазы 2 (CUB7402; NeoMarkers, Фремонт, Калифорния) с последующим введением антител, конъюгированных с родамином. -мышиные антитела IgG (Dako).Ранее было показано, что отложения IgA в слизистой оболочке специфически направлены против трансглутаминазы 2 (23,24). Все оценки проводились без учета истории болезни или лабораторных данных.

ОТ-ПЦР энтеровируса.

Для ОТ-ПЦР нефиксированные образцы биопсии хранили замороженными в среде с оптимальной температурой для резки при -70 ° C. Образцы биопсии удаляли из среды с оптимальной температурой резки и гомогенизировали с использованием гомогенизатора SilentCrusher S (Heidolph, Schwabach, Германия).РНК экстрагировали с помощью набора RNeasy Mini Kit (Qiagen, Hilden, Германия). ОТ-ПЦР выполняли с использованием двух независимых методов: ранее описанного метода амплификации последовательности, общей для всех известных серотипов энтеровирусов (25), и ОТ-ПЦР в реальном времени с использованием тех же праймеров и зондов. Образец считался положительным на энтеровирус, если он давал положительный сигнал хотя бы в одном из этих анализов.

Статистический анализ.

Статистический анализ проводился с использованием SPSS 18.0 для Windows. Сравнение частот выполнялось с помощью точных критериев Пирсона χ ² и Фишера, а непрерывные переменные анализировались с помощью теста независимой выборки t .

РЕЗУЛЬТАТЫ

Образцы биопсии тонкого кишечника сначала были проверены на наличие генома энтеровируса с использованием метода ISH. Было обнаружено, что 74% пациентов с диабетом 1 типа по сравнению с 29% контрольных субъектов оказались вирусно-положительными ( P <0,001) (таблица 2 и рис. 1). Более высокая частота явно положительных сигналов гибридизации наблюдалась особенно у пациентов с диабетом (51 против 5%; P <0,001) (Таблица 2). РНК энтеровируса в основном располагалась в эпителиальных клетках ворсинок и крипт; однако также наблюдалось случайное окрашивание собственной пластинки.Образец для последующего наблюдения был получен от трех пациентов с диабетом, у которых был энтеровирус положительный в исходном образце (взятом через 1 год после первоначального образца). Все они остались положительными на энтеровирус. Обнаружение энтеровирусов не было связано с возрастом, полом, аллелями HLA DQ2 и / или DQ8 или продолжительностью диабета или целиакии (данные не показаны).

ТАБЛИЦА 2

Субъекты, положительные по РНК энтеровируса по ISH в образцах биопсии тонкой кишки

Фиг. 1.

Обнаружение РНК энтеровируса с помощью ISH в биоптатах кишечника пациентов с диабетом 1 типа, включая слабоположительные ( A ), умеренно положительные ( B ) и сильно положительные ( C ) случаи. D : Иммуногистохимическое окрашивание на белок VP1 энтеровируса. Стрелки указывают на клетки, положительные по РНК энтеровируса ( A ) и белку VP1 ( D ). (Высококачественное цифровое представление этого числа доступно в онлайн-выпуске.)

Затем присутствие вирусной РНК было подтверждено с помощью ОТ-ПЦР. Свежезамороженный образец биопсии был доступен у 26 пациентов с диабетом, 34 пациентов с глютеновой болезнью и 31 контрольного субъекта, и ОТ-ПЦР обнаружила вирус у 19, 15 и 10% из них соответственно.Вирус обнаруживался чаще у ISH-положительных, чем у ISH-отрицательных субъектов (12 из 50 против 1 из 41; P <0,01).

На следующем этапе мы проанализировали, связано ли присутствие вирусной РНК с продукцией вирусного белка VP1 (см. Дополнительную таблицу 5). Большинство субъектов, которые были положительными на вирусную РНК в ISH, были отрицательными на белок VP1 в иммуногистохимии. В целом, белок VP1 был обнаружен у 22, 20 и 22% из 30 пациентов с диабетом, 37 пациентов с глютеновой болезнью и 41 контрольной группы, соответственно (рис.1). Белок VP1 в основном наблюдался в эпителиальных клетках крипт. Доля VP1-отрицательных субъектов среди всех РНК-положительных субъектов, как правило, была выше среди пациентов с диабетом и глютеновой болезнью, чем в контрольной группе (78 и 86 против 66%).

Наконец, наличие вирусной РНК (ISH) коррелировали с маркерами воспаления в слизистой оболочке кишечника. Всего 23 пациента с диабетом типа 1, 40 пациентов с целиакией и 41 контрольный субъект были проанализированы на наличие внутриэпителиальных лимфоцитов CD3 ⁺ , αβ ⁺ и γδ ⁺ и клеток HLA-DR ⁺ .Вирусная РНК была связана с инфильтрацией клеток αβ ⁺ , γδ ⁺ и HLA-DR ⁺ (таблица 3). Наличие маркеров воспаления было связано с положительностью РНК энтеровируса во всей когорте исследования, и эта тенденция также наблюдалась у пациентов с диабетом в отношении γδ IEL (46 против 17%, соответственно) и экспрессии HLA-DR (46 против 0%). , но из-за небольшого числа пациентов с диабетом, положительных по маркерам воспаления, результаты не достигли статистической значимости (данные не показаны).Среднее соотношение клеток γδ ⁺ к CD3 ⁺ было также выше у вирус-положительных, чем у вирус-отрицательных субъектов (0,24 против 0,17; P = 0,043). Помимо воспаления, опосредованного Т-клетками, воспаление, опосредованное антителами (отложения IgA), чаще встречалось у вирус-положительных, чем у вирус-отрицательных субъектов (54 против 31%; P = 0,023) (Таблица 3). Как и ожидалось, маркеры воспаления чаще всего встречались у пациентов с глютеновой болезнью в целом, но пациенты с диабетом, у которых не было целиакии, также имели тенденцию к повышенному IEL γδ ⁺ , экспрессии HLA-DR и отложению IgA по сравнению с контрольными субъектами ( Таблица 4 и дополнительные рисунки.2 и 3). У них также было более высокое среднее отношение клеток γδ ⁺ к CD3 ⁺ (0,18 против 0,09; P = 0,028). Однако воспаление было явно намного слабее в группе диабета, чем в группе глютеновой болезни.

ТАБЛИЦА 3

Маркеры воспаления у субъектов ISH ⁺ и ISH ^—

ТАБЛИЦА 4

Субъекты с повышенной плотностью CD3, αβ и γδ Т-клеток, экспрессией HLA-DR и целевыми отложениями IgA в слизистой оболочке кишечника

ОБСУЖДЕНИЕ

Настоящее исследование предполагает, что слизистая оболочка кишечника пациентов с диабетом 1 типа часто инфицирована энтеровирусами.Полученные данные хорошо согласуются с персистентностью вируса, феноменом, который обычно наблюдается при пикорнавирусных инфекциях и может привести к длительному воспалению и повреждению тканей (26). Это наблюдение также подтверждает наше более раннее исследование, показывающее подобное явление у небольшой подгруппы пациентов с диабетом и контрольной группы (18).

Несколько факторов позволяют предположить, что это наблюдение может иметь клиническое значение. Во-первых, присутствие РНК энтеровируса было связано с повышенной активностью воспаления в слизистой оболочке кишечника, включая как клеточно-опосредованное, так и опосредованное антителами воспаление (накопление IELs и отложений IgA).Во-вторых, вирус чаще обнаруживался у пациентов с диабетом 1 типа, чем у контрольных субъектов, что позволяет предположить, что он может играть роль в процессе болезни. В-третьих, наши результаты согласуются с длительной инфекцией и персистенцией вируса в слизистой оболочке кишечника: вирус был обнаружен в контрольной пробе, взятой после 1 года наблюдения у всех трех пациентов с диабетом, которые изначально были вирус-положительными и у которых были взяты такие контрольные пробы. доступный. Устойчивость вируса также подтверждается тем фактом, что вирусный геном (РНК) часто встречается в отсутствие вирусных белков, и это чаще наблюдается в группе пациентов, чем в контрольной группе.Такой дисбаланс между вирусной РНК и экспрессией белка ранее был связан с персистенцией энтеровируса, показывая, что синтез капсидного белка энтеровируса снижается при персистирующей инфекции и что репликация вируса происходит в основном на уровне РНК без образования инфекционного вируса (15,17). Аналогичное открытие в ткани эндомиокарда человека показывает присутствие энтеровирусной РНК без продукции вирусного белка VP1 при идиопатической дилатационной кардиомиопатии и хронической коронарной болезни (27). В целом, текущее исследование хорошо согласуется с предыдущими наблюдениями на перорально инфицированных мышах, показывающими, что энтеровирус может сохраняться в слизистой оболочке кишечника (14,28).Соответственно, вирус, обнаруженный у этих пациентов, мог сохраняться в течение более длительного периода. Однако в свете настоящего исследования невозможно сделать вывод, инфицировал ли он этих людей до или после диагноза диабета 1 типа. Исследования показали, что большая часть пациентов с диабетом 1 типа уже имеет положительный результат на энтеровирус в крови при диагностике диабета и даже раньше, в ходе патогенеза, близко к появлению островковых аутоантител (6,7,29,30).

Не исключено, что люди, предрасположенные к диабету 1 типа, предрасположены к энтеровирусным инфекциям и их персистированию.Теоретически такая восприимчивость может быть опосредована генетическими факторами, обуславливающими восприимчивость к диабету 1 типа. Известно, что некоторые из этих генов восприимчивости, такие как гены HLA и IFIh2 , влияют на иммунные ответы против энтеровирусов (9,31). Однако нет доступных исследований возможной роли этих генов в развитии персистенции энтеровирусов. В текущем исследовании обнаружение РНК энтеровируса не было связано с генами риска HLA для диабета 1 типа, что противоречит основному эффекту генов HLA.Помимо генетических факторов, гипергликемия предрасполагает к инфекциям. Следовательно, мы не можем исключить возможность того, что диабет сам по себе может предрасполагать к длительным энтеровирусным инфекциям. Однако обнаружение энтеровируса не было связано с длительностью диабета 1 типа, что косвенно говорит против такой возможности.

Интенсивность окрашивания и количество положительных клеток в ISH варьировались между группами исследования, при этом пациенты с диабетом 1 типа демонстрировали значительно более высокую положительность, чем пациенты с глютеновой болезнью и контрольные субъекты.Это говорит о том, что вирус реплицируется на более высоком уровне у пациентов с диабетом, производя больше молекул РНК и заражая больше клеток. Очень слабые положительные результаты были относительно часто также среди субъектов, контролирующих заболевание, что позволяет предположить, что легкая инфекция могла способствовать неспецифическим желудочно-кишечным симптомам у некоторых из них.

РНК вируса была обнаружена с использованием различных методов, включая анализы ISH и RT-PCR. Несмотря на то, что они дали параллельные результаты, было очевидно, что положительный результат на энтеровирус был более частым при ISH, чем при RT-PCR.Это можно объяснить тем фактом, что для этих двух методов требовались два отдельных образца биопсии, а также методологическими различиями в предварительной обработке образцов и возможным присутствием ингибиторов ПЦР, которые снижают чувствительность ПЦР (18).

В заключение мы предполагаем, что стойкая энтеровирусная инфекция слизистой оболочки кишечника может играть роль в патогенезе диабета 1 типа. Слизистая оболочка кишечника может быть важным резервуаром вируса, из которого вирус может распространяться в поджелудочную железу, которая анатомически очень близка и имеет общие лимфатические и сосудистые сети.Кроме того, вирусная персистенция в слизистой оболочке кишечника может поддерживать среду хронического воспаления в этой сети, что может способствовать аутореактивности островков за счет механизма активации стороннего наблюдателя. Например, γδ ⁺ Т-клетки, которые были четко связаны с присутствием энтеровируса в слизистой оболочке кишечника, способствуют аутоиммунитету при миокардите, вызванном энтеровирусами, путем ингибирования активности регуляторных Т-клеток (32).

БЛАГОДАРНОСТИ

Это исследование финансировалось грантами Фонда исследований ювенильного диабета, Фонда Зольберга, Фонда Сигрид Джуселиус, Академии Финляндии и Конкурсного финансирования исследований больницы Университета Тампере.Кроме того, часть исследования финансировалась проектом PEVNET (Европейская седьмая рамочная программа GA-261441-PEVNET).

H.H. является миноритарным (<5%) акционером и членом правления Vactech Ltd, которая разрабатывает вакцины против пикорнавирусов. О других потенциальных конфликтах интересов, относящихся к этой статье, не сообщалось.

M.O. разработал исследование, участвовал в разработке методов, анализировал данные, участвовал в интерпретации данных и помогал подготовить рукопись.S.T. разработал исследование, внес вклад в интерпретацию данных и помог подготовить рукопись. ТАК. и Т. участвовал в разработке методов и помогал подготовить рукопись. ПК. проанализировал данные и помог подготовить рукопись. I.R. помог подготовить рукопись. М.М. собрали образцы, внесли свой вклад в интерпретацию данных и помогли подготовить рукопись. К.К. собрали образцы, проанализировали данные, внесли свой вклад в интерпретацию данных и помогли подготовить рукопись. Х.Х. разработал исследование, внес свой вклад в интерпретацию данных и помог подготовить рукопись.М.О. является гарантом этой работы и, как таковой, имеет полный доступ ко всем данным в исследовании и берет на себя ответственность за целостность данных и точность анализа данных.

Авторы благодарят Эеву Толванен и Маарит Патрикайнен (Отделение вирусологии Медицинского факультета Университета Тампере) и Эйни Эсколу и Марью-Лину Коскинен (Отделение патологии Медицинского факультета Университета Тампере) за техническую помощь.

• Поступила 18.08.2011.
• Принято 3 декабря 2011 г.

• © 2012 Американской диабетической ассоциацией.

Молекулярный механизм энтеровирусной инфекции раскрыт

Исследователи из Нанонаучного центра Университета Ювяскюля в сотрудничестве с сотрудниками Университета Хельсинки обнаружили, что белки организма, называемые альбумином, и определенные ионы в атакованных клетках-хозяевах могут влиять на генетическую работу энтеровирусов и усиливать их инфекцию.Результаты их исследования опубликованы в последнем выпуске журнала Journal of Virology в этом месяце. Исследование называется «Внеклеточный альбумин и эндосомные ионы — основные частицы энтеровируса для удаления оболочки, которые можно предотвратить с помощью насыщения жирными кислотами».

Это энтеровирусы в электронном микроскопе. Альбумин помогает энтеровирусам раскрыться. Кредит изображения: Университет Хельсинки и Университет Ювяскюля / Visa Ruokolainen и Ausra Domaska ​​

Исследователи объясняют, что энтеровирусы — одна из самых распространенных инфекций, приводящих как к острым, так и к хроническим инфекциям.Это успешные вирусы, которые могут вызывать несколько инфекционных заболеваний. Большинство этих инфекций протекают в легкой форме, но если вирус поражает центральную нервную систему, инфекция может стать серьезной. К примеру, вирусы полиомиелита — это энтеровирусы, а также вирусы, вызывающие заболевание рук, ящура и рта (HFMD). У 9 из 10 инфицированных могут быть легкие симптомы инфекции или их отсутствие. У других может быть высокая температура, гриппоподобное заболевание, боли в мышцах и теле и сыпь, а также желудочно-кишечные симптомы, такие как боли в животе, судороги и диарея.По данным Европейского центра профилактики и контроля заболеваний, инфекция распространяется через выделения инфицированных людей, включая слюну, слизь, мокроту или кал. Дети наиболее уязвимы для этой инфекции, и к людям с риском осложнений этой инфекции относятся молодые, старые, беременные или люди с низким иммунитетом.

Группа исследователей пишет, что молекулярные механизмы, объясняющие, почему энтеровирусные инфекции более тяжелые у некоторых и обычно легкие у большинства людей, не были хорошо изучены.Для этого команда использовала измерения в реальном времени обнаружения вируса в высоком разрешении. Их команда состояла из группы Варпу Марйомяки (Центр нанонаук при Университете Ювяскюля) и группы профессора Сары Бутчер (Университет Хельсинки). Они отметили, что в сыворотке есть общая молекула, а также интерстициальные жидкости, состоящие из альбумина и ионов из пузырьков клеток, которые могут способствовать размножению вирусных частиц.

Иллюстрация энтеровируса D68, вызывающего респираторные инфекции у детей.Кредит изображения: Катерина Кон / Shutterstock

Исследователи отметили, что вирус становится более расширенным и фенестрированным. Это позволяет более мелким молекулам, таким как ионы, входить в него. Команда объясняет, что до того, как ионы смогут проникнуть внутрь, вирусная частица сначала заряжается альбумином, присутствующим в клетке-хозяине. Примированная альбумином вирусная частица становится «метастабильной» или «инфекционным промежуточным звеном», пишут. Когда ионы входят в вирусную частицу, они изменяют геном, вызывая высвобождение генома, и это способствует размножению вируса в организме.

Команда использовала радиоактивно меченные частицы энтеровируса и выполнила спектроскопию в реальном времени с использованием градиентов сахарозы. Они объяснили, что при 37 градусах альбумин в клетке-хозяине запускает «метастабильный непокрытый промежуточный продукт эховируса 1 без взаимодействия с рецептором». Они также добавили, что этот процесс активации вируса альбумином можно заблокировать путем насыщения альбумина, присутствующего в клетках-хозяевах, жирными кислотами. Используя эховирусы, они отметили, что высокие уровни калия, но более низкие уровни натрия и кальция могут имитировать среду внутри эндосомного аппарата клетки.Они также писали, что это может помочь в «образовании метастабильного промежуточного продукта без оболочки эховируса 1». После того, как ионы и альбумин облегчили процесс, команда написала, что РНК явно была «прикреплена к капсиду». Их результат показал, что альбумин извне клеток-хозяев, «частично насыщенный жирными кислотами», может приводить к «инфекционному промежуточному продукту без оболочки до взаимодействия с клеточным рецептором». Они пришли к выводу, что, кроме того, катионы, обнаруженные в эндосомах клеток, «способствуют раскрытию капсида и высвобождению генома».«Все это может быть задокументировано с помощью криоэлектронной микроскопии», — написала команда.

Варпу Марйомяки из Нанонаучного центра Университета Ювяскюля в заявлении говорится: «Успешное высвобождение генома — один из шагов, ограничивающих скорость заражения вирусом. Это должно произойти в нужном месте в нужное время, чтобы обеспечить эффективное заражение. Эта работа дает новое понимание этого фундаментального аспекта жизненного цикла энтеровирусов и может дать цели для терапевтических разработок.”

По словам авторов, это было первое исследование, «сфокусированное на физиологически значимых факторах, которые, вероятно, способствуют раскрытию эховируса 1 и других энтеровирусов B-группы». В заключение они написали: «Перед тем, как попасть в клетки, внеклеточный альбумин способен привести вирус в метастабильное, но инфекционное промежуточное состояние. Ионные изменения, которые, как предполагается, происходят в эндосомах, могут дополнительно способствовать отслаиванию оболочки и способствовать высвобождению генома после эндоцитоза вирусной частицы.Они добавили: «Это исследование предоставляет ценную информацию о физиологических факторах, которые способствуют открытию энтеровирусов группы B.»

Ссылка на журнал:

Внеклеточный альбумин и эндосомальные ионы — главные частицы энтеровируса для удаления оболочки, которые можно предотвратить за счет насыщения жирными кислотами, Виза Руоколайнен, Аушра Доманска, Мира Лааяла, Мария Пелличча, Сара Дж. Бутчер, Аугпу Марджомаки, 2019, Журнал вирусологии , 93 (17) e00599-19; DOI: 10.1128 / JVI.00599-19, https: // jvi.asm.org/content/93/17/e00599-19

Анализ затрат на энтеровирусную полимеразную цепную реакцию у младенцев с лихорадкой и плеоцитозом спинномозговой жидкости | Инфекционные болезни | JAMA Педиатрия

Фон
Младенцы с лихорадкой и плеоцитозом спинномозговой жидкости (ЦСЖ) обычно поступают в больницу для парентеральной антибактериальной терапии по поводу потенциального бактериального менингита до получения результатов посева ЦСЖ. По опубликованным оценкам, 90% всех эпизодов менингита вызваны энтеровирусом.Энтеровирусная полимеразная цепная реакция (ePCR) имеет чувствительность от 92% до 100% и специфичность от 97% до 100% в спинномозговой жидкости.

Объектив
Сравнить стратегию управления с использованием ePCR с текущей практикой, чтобы определить потенциальную экономию за счет более ранней выписки.

Методы
Анализ решения, сравнивающий 2 стратегии лечения ретроспективной когорты младенцев с лихорадкой и плеоцитозом спинномозговой жидкости: стандартная практика и тестирование всех образцов спинномозговой жидкости с помощью электронной ПЦР.Допущения модели включают следующее: (1) пациенты стандартной практики продолжают парентеральную терапию антибиотиками до тех пор, пока посев спинномозговой жидкости не станет отрицательным через 48 часов, (2) пациенты с положительными результатами ePCR будут выписаны через 24 часа, (3) пациенты с положительными результатами ePCR будут отрицательный посев спинномозговой жидкости, и (4) затраты рассчитываются на основе фактических затрат пациента с соотношением затрат к оплате 0,65.

Субъекты
Все младенцы в возрасте от 28 дней до 12 месяцев поступили в городскую клиническую больницу с лихорадкой, плеоцитозом спинномозговой жидкости и отрицательной окраской по Граму спинномозговой жидкости с января 1996 года по декабрь 1997 года.

Результат
Общая стоимость госпитализации.

Результаты
Всего было идентифицировано 126 младенцев. Сто двенадцать (89%) были выписаны с диагнозом асептический менингит; 72% этих случаев произошли в пик сезона энтеровирусов (с июня по октябрь). У трех из 3 пациентов с положительными культурами спинномозговой жидкости в течение 24 часов после госпитализации наблюдался рост бактерий. Средняя продолжительность пребывания пациентов с асептическим менингитом составила 2,3 дня (SD, ± 1.4 дня). Общая стоимость стационарного лечения для всех 126 младенцев составила 381 145 долларов. В нашей популяции пациентов общие расходы на пациента будут снижены с помощью стратегии ePCR, если на энтеровирус приходится более 5,9% всех случаев менингита. Изменение чувствительности анализа ePCR от 100% до 90% изменяет распространенность «безубыточности» с 5,8% до 6,5%. Общая экономия затрат на 10%, 20% и 30% будет достигнута при распространенности энтеровирусного менингита 36,3%, 66,7% и 97,1% соответственно.

Выводы
Энтеровирусный ПЦР-анализ спинномозговой жидкости у младенцев, поступивших в больницу с менингитом, может привести к экономии средств, если распространенность энтеровирусного менингита превышает 5.9%. Ограничение использования ePCR сезоном энтеровируса увеличит экономию средств. Для подтверждения этих результатов необходимо проспективное исследование.

ОЦЕНКА младенцев с высокой лихорадкой и плеоцитозом спинномозговой жидкости (CSF) включает антибактериальную терапию широкого спектра и госпитализацию. В большинстве случаев бактериальные культуры остаются отрицательными, и ребенок выписывается с диагнозом асептический менингит. Неполиомиелитные энтеровирусы являются инфекционным агентом по крайней мере в 66% и до 90% этих случаев, причем пик заболеваемости приходится на конец лета и начало осени в умеренном климате. ^{1 -3} Наиболее распространенными серотипами энтеровирусов, ассоциированными с асептическим менингитом, являются Коксаки B5; эховирусы 4, 6, 9 и 11; и пронумерованные энтеровирусы. За пределами ближайшего неонатального периода (> 28 дней жизни) энтеровирусный менингит ассоциируется с доброкачественным клиническим течением. ^{4 , 5} Текущие терапевтические вмешательства при энтеровирусных инфекциях центральной нервной системы ограничиваются поддерживающей терапией, хотя новые противовирусные методы лечения находятся в стадии разработки.

Диагноз энтеровирусной инфекции ранее ставился с помощью вирусной культуры инфицированной жидкости организма, для которой требуется комбинация линий диплоидных фибробластов почек обезьяны и человека. Обнаруживаемый рост вируса происходит между 3,7 и 8,2 днями (в среднем 4,2 дня) с момента инокуляции, и, следовательно, результаты, как правило, недоступны в клинически значимых временных рамках. ⁶ Более того, многие клинически значимые серотипы не растут в обычных вирусных культурах. ⁷

Недавно микробиологические разработки позволили применить технологию полимеразной цепной реакции с обратной транскриптазой (ПЦР) для диагностики энтеровирусных инфекций. Клинические испытания этого нового метода на спинномозговой жидкости для диагностики менингита оказались значительно более чувствительными, чем посев. ⁸ В анализе энтеровирусной ПЦР (ePCR) используется простая колориметрическая методика обнаружения, результаты которой доступны в течение 5 часов. ⁹ При использовании стандартизованных образцов или образцов от пациентов с отрицательными вирусными культурами спинномозговой жидкости, но с энтеровирусом, идентифицированным в другом месте (кровь, горло или стул), опубликованные в настоящее время диапазоны ePCR CSF для чувствительности составляют от 92% до 100%, а для специфичности — 97 % до 100%. ^{10 -13}

Мы предполагаем, что клиническое применение ePCR в диагностике менингита даст потенциальную экономию средств с точки зрения более короткого пребывания в больнице и уменьшения использования антибиотиков. Несколько моделей ранней выписки уже предсказали значительное сокращение больничных расходов. ^{14 , 15} Это исследование моделирует универсальное применение ePCR для младенцев, госпитализированных с менингитом, для определения распространенности энтеровирусной инфекции, необходимой для достижения экономии средств.

Мы просмотрели все истории болезни Детской больницы, Бостон, Массачусетс, отделения неотложной помощи с 1 января 1996 г. по 31 декабря 1997 г., используя компьютеризированный поисковый инструмент для выявления всех младенцев в возрасте от 28 дней до 12 месяцев с лихорадкой (температура ≥38 ° C). ) и плеоцитоз спинномозговой жидкости (количество лейкоцитов ≥0,006 × 10 ⁹ / л). Всего было идентифицировано 166 младенцев.

Мы ограничили нашу исследуемую популяцию пациентами, у которых нельзя сразу определить источник лихорадки и у которых положительный результат ePCR может повлиять на последующее лечение.Таким образом, 40 пациентов были исключены. Десять младенцев были исключены из-за определенного бактериального менингита с окрашиванием ЦСЖ по Граму, показывающим микроорганизмы. Десять были исключены на основании следующих диагнозов: инфекция мочевыводящих путей с более чем 10-20 лейкоцитами на поле высокого увеличения (7 пациентов), положительный посев крови при поступлении (2 пациента) и периорбитальный целлюлит (1 пациент). . Пятнадцать пациентов были исключены на основании распознаваемого вирусного синдрома, который в остальном диктовал их клиническое лечение (9 пациентов с гастроэнтеритом были госпитализированы из-за обезвоживания и 6 пациентов с бронхиолитом были госпитализированы из-за респираторного дистресса / гипоксии).Наконец, 5 пациентов были исключены из-за недавней установки вентрикулоперитонеального шунта, что связано с повышенным риском бактериальной инфекции центральной нервной системы. ¹⁶ Мы включили младенцев с кровавыми спинномозговыми пунктами, поскольку лечащие врачи считали результаты СМЖ не интерпретируемыми. Мы определили диагнозы при выписке для каждого пациента, независимо изучив медицинскую карту и результаты посева спинномозговой жидкости. Мы определили продолжительность пребывания, подсчитав количество дней, в течение которых каждый пациент находился в больнице в полночь.Утверждение для обзора диаграммы было предоставлено наблюдательным советом детской больницы (протокол 98-11-089).

Мы определили фактические затраты на госпитализацию для каждого пациента из больничных счетов на основе уровней 1996-1997 годов. При расчетах затрат использовалось стандартное соотношение затрат и затрат, равное 0,65. Ночлег в больнице стоил 637 долларов за ночь, включая услуги медсестры. Внутривенное введение цефотаксима (доза 200 мг / кг в день, разделенная на 4 дневные дозы для ребенка весом 6 кг) стоило 96 долларов в день, включая приготовление лекарства и введение.Лечащий врач уровня I стоил 107 долларов в первый день и 65 долларов в последующие дни, исходя из оплаты в местной частной педиатрической практике. Таким образом, стоимость одного больничного дня после первого дня составила 798 долларов. Стоимость ePCR с обратной транскриптазой была оценена в 90 долларов, исходя из ожидаемых коммерчески доступных материалов (35 долларов) плюс трудозатраты (55 долларов) на обработку серийных образцов. Создание специального лабораторного помещения в лечебном цехе не было включено в нашу модель затрат.

Для сравнения стандартного лечения с универсальным тестированием ePCR использовалась стратегия минимизации затрат.Модель предполагает следующее: (1) стандартная практика состоит из парентеральной терапии антибиотиками до тех пор, пока посевы спинномозговой жидкости не станут отрицательными через 48 часов; (2) результаты тестирования ePCR доступны в течение 24 часов после поступления для всех пациентов; (3) пациенты с положительной эПЦР выписываются через 24 часа; и (4) пациенты с положительными результатами эПЦР и отрицательными бактериальными культурами в спинномозговой жидкости через 24 часа останутся отрицательными по культуре. Экономия в расчете на одного пациента включала в себя стационарную больничную койку, антибиотики и плату за стационарное лечение.Экономия затрат была рассчитана в диапазоне от 0% до 100% распространенности энтеровирусного менингита в исследуемой популяции. Использовали чувствительность ePCR 99% и специфичность 97%. Анализ чувствительности проводился путем изменения чувствительности ePCR в диапазоне от 90% до 100%. Анализ затрат также проводился путем варьирования процентной доли пациентов, выписанных через 24 часа, в диапазоне от 50% до 100%.

На рисунке 1 показан анализ применяемых решений.В общей сложности 126 младенцев в возрасте от 28 дней до 12 месяцев с лихорадкой, плеоцитозом спинномозговой жидкости и отсутствием другого диагноза отделения неотложной помощи были госпитализированы для лечения менингита. Диагноз при выписке у этих пациентов: асептический менингит (112 пациентов), бактериальный менингит (7 пациентов) и инфекция мочевыводящих путей (7 пациентов). Только у 3 пациентов с бактериальным менингитом патогены росли в культурах спинномозговой жидкости. Все 3 организма выросли к 24 часам. Остальные 4 пациента были предварительно обработаны антибиотиками, что сделало культуру спинномозговой жидкости непонятной для лечащего врача.Пациенты с диагнозом асептического менингита при выписке имели среднюю продолжительность пребывания в стационаре 2,3 дня (стандартное отклонение ± 1,4 дня).

Рисунок 1.

Анализ решения был применен к 126 исследованным младенцам (N). Выбор делается между стандартным лечением и тестированием энтеровирусной полимеразной цепной реакции (ePCR) для всех младенцев. Общая стоимость стандартного лечения для пациента (TC) составляет 381 145 долларов США. Стоимость энтеровирусного тестирования для всех пациентов (ePCRC) составляет 11340 долларов. P указывает на распространенность энтеровирусной инфекции в этой популяции.Истинные положительные результаты происходят при чувствительности P ×. Ложноположительные результаты происходят с вероятностью (1 — P) (1 — специфичность). Расчеты экономии затрат для стратегии тестирования ePCR зависят от P. Для энтеровирусного тестирования затраты рассчитываются по TC + ePCRC — [P × 0,99 × 126 × 1037] — [(1 — P) × 0,03 — 126 × 1037] = 388 565 долл. США — 125 436 долл. США Для расчетов использовали чувствительность ePCR 99% и специфичность 97%.

Стратегия минимизации затрат, применявшаяся к исследуемым пациентам, изображена на Рисунке 1.Общая стоимость 126 пациентов, участвовавших в исследовании, составила 381 145 долларов, исходя из фактических счетов. Тестирование с помощью ePCR для всех 126 пациентов обошлось бы в 11340 долларов. Положительный результат ePCR позволит сэкономить 1,3 больничных дня на каждого пациента, поскольку выписка из больницы осуществляется через 24 часа. Экономия в размере 1037 долларов на пациента была рассчитана с использованием предположений о стоимости, указанных в разделе «Пациенты и методы» (1,3 × стоимость в день = 1,3 × 798 долларов).

Точка безубыточности была определена как распространенность, при которой плата за выполнение анализа ePCR была точно равна сэкономленным расходам на госпитализацию, как показано на Рисунке 2.Это совпадение наблюдалось при распространенности энтеровирусов 5,9% среди детей с плеоцитозом спинномозговой жидкости. Общая экономия затрат на 10%, 20% и 30% будет достигнута при распространенности энтеровирусного менингита 36,3%, 66,7% и 97,1% соответственно.

Рисунок 2.

Общая экономия затрат на основе ранней выписки из больницы для диапазона распространенности энтеровирусов у пациентов с асептическим менингитом. Расстояние между стандартной терапевтической линией и линиями тестирования энтеровирусной полимеразной цепной реакции (ePCR) представляет собой потенциальную экономию средств.Распространенность безубыточности (длинная стрелка) составляет 5,8% при чувствительности ePCR 100% и 6,9% при чувствительности ePCR 90%. Более короткие стрелки указывают приблизительную распространенность энтеровирусов, необходимую для достижения 10%, 20% и 30% общей экономии затрат.

Экономия затрат зависит от фактической чувствительности анализа ePCR. Если фактическая чувствительность анализа составляет 90%, что значительно ниже опубликованных оценок, распространенность безубыточности составит 6,5%. Если фактическая чувствительность составляет 100%, точка безубыточности наступает при 5.Распространенность 8%.

Если только 50% младенцев с положительными результатами эПЦР фактически выписываются через 24 часа, точки безубыточности возникают с распространенностью 13,5% с чувствительностью 90% и распространенностью 12,1% с чувствительностью 100%.

На рис. 3 изображен диагноз выписки у исследуемых пациентов по месяцам. 72% младенцев с асептическим менингитом ежегодно попадают в больницу в период с июня по октябрь во время пикового сезона энтеровирусных инфекций.Заболеваемость бактериальным менингитом и инфекцией мочевыводящих путей в образце остается постоянной в течение года.

Рисунок 3.

Пациенты в исследовании представлены на графике по месяцам поступления в больницу и диагнозу выписки: асептический менингит и другие заболевания (бактериальный менингит и инфекция мочевыводящих путей). Самая высокая распространенность асептического менингита наблюдалась в период с июня по октябрь.

Менингит — это распространенная детская инфекция, которая требует госпитализации и парентеральной антибактериальной терапии, хотя большинство случаев вызвано вирусными, а не бактериальными патогенами.Используя предположения нашей модели, мы обнаружили, что ePCR является рентабельной стратегией при ведении младенцев с лихорадкой и плеоцитозом спинномозговой жидкости. Если бы фактическая распространенность энтеровирусного менингита была выше 5,9%, скрининг госпитализированных пациентов с помощью ePCR привел бы к общей экономии затрат за счет более ранней выписки из больницы. Оценки распространенности энтеровирусного менингита у младенцев с плеоцитозом спинномозговой жидкости колеблются от 66% до 90% в зависимости от сезона. ^{1 -3} Таким образом, во всем вероятном диапазоне распространенности энтеровирусов стратегия тестирования ePCR обеспечивает экономию средств.Анализ чувствительности показывает лишь небольшое изменение (5,8% -6,5%) в распространенности безубыточности в диапазоне чувствительности анализа ePCR от 100% до 90%.

Наша диагностическая стратегия имеет следующие ограничения. В этом анализе использовались только прямые затраты на госпитализацию. Косвенные расходы, такие как пропущенные рабочие дни родителей или дополнительные расходы по уходу за ребенком, а также пособия семье при досрочном выписке не включены. Не все дети с задокументированными энтеровирусными инфекциями будут готовы к выписке через 24 часа.Только пациенты, которые клинически здоровы, могут быть выписаны раньше срока. Многие младенцы будут ассоциироваться с плохим пероральным приемом пищи, продолжающимися диарейными потерями или рвотой, сильной лихорадкой или поведенческими изменениями. Эти клинические критерии потенциально могут сократить количество младенцев, действительно имеющих право на раннюю выписку, и, в свою очередь, снизить расчетную экономию затрат. Однако даже при изменении процента соответствующих критериям пациентов, которые фактически выписаны, до 50%, точка безубыточности по-прежнему достигается с относительно низкой распространенностью (12.1% -13,5% в диапазоне чувствительности от 100% до 90%) энтеровирусной инфекции. Дополнительные расходы могут возникнуть, если новорожденные, выписанные раньше срока, вернутся к своему терапевту или в отделение неотложной помощи для повторного осмотра.

Ключевым предположением нашего анализа решений является то, что пациенты с задокументированным энтеровирусным заболеванием не имеют сопутствующей бактериальной инфекции центральной нервной системы. Ложноположительный результат ePCR может позволить пациенту с истинным бактериальным менингитом (который выглядит клинически здоровым) раньше выписаться.Вероятность ложноположительного результата зависит от распространенности истинной инфекции в исследуемой популяции, а также от специфичности теста ePCR (при опубликованной специфичности 97% эта вероятность дается следующей формулой: [1 — Специфичность] × [1 — Распространенность] = 0,03 × [1 — Распространенность]).

Ранняя выписка младенца с бактериальным менингитом будет происходить только в двух различных сценариях: (1) у младенца был ложноположительный результат ePCR и ложноотрицательный 24-часовой посев спинномозговой жидкости или (2) у младенца был истинный — положительный результат ePCR и ложноотрицательный 24-часовой посев спинномозговой жидкости.Выписка пациента по любому из этих сценариев, безусловно, отрицательно повлияет на результат; однако мы считаем, что вероятность реализации любого из этих сценариев довольно мала.

Сценарий 1 представляет пациента, у которого есть бактериальный, но не вирусный менингит, и чьи культуры спинномозговой жидкости не были положительными во время потенциальной выписки (24 часа). В нашей исследуемой популяции только 2,3% культур спинномозговой жидкости дали бактерии, и все организмы были идентифицированы в течение 24 часов после инокуляции.Обзор культур спинномозговой жидкости из нашей лаборатории показал, что 73% всех положительных культур спинномозговой жидкости вырастили патогены в течение 24 часов, а также наиболее распространенные патогены ( Streptococcus pneumoniae , Escherichia coli , Neisseria meningitidis и группа стрептококков). B), 42 (98%) из 43 культур спинномозговой жидкости были положительными в течение 24 часов (AB Macone, PhD, Отдел лабораторной медицины, Детская больница, Бостон, неопубликованные данные, с января 1993 г. по декабрь 1997 г.).Сценарий 1 явно представляет меньшинство пациентов с бактериальным менингитом. В качестве меры предосторожности против неблагоприятных исходов в результате преждевременной выписки пациентов с бактериальным менингитом можно ввести дозу цефалоспорина длительного действия до выписки в ожидании окончательных результатов посева. ¹⁷ Однако наша модель не учитывает стоимость дополнительной дозы антибиотиков.

Сценарий 2 представляет пациента, у которого есть и вирусный, и бактериальный менингит.В недавнем исследовании 345 детей младше 90 дней с лихорадкой и диагностируемым энтеровирусным заболеванием ни у одного не было бактериального менингита. ¹⁸ Появляется все больше доказательств того, что риск бактериемии может быть снижен и при других идентифицируемых вирусных синдромах. ^{19 , 20} Кроме того, как и в случае сценария 1, ранняя выписка будет происходить только у пациентов с бактериальным менингитом, которые клинически благополучно выглядели через 24 часа и имели отрицательные 24-часовые культуры спинномозговой жидкости.

Следует отметить, что наше исследование не учитывает возможность ухудшения тестовых характеристик тестирования ePCR в «реальном» использовании. Широко распространенное тестирование ePCR потребует очень строгих стандартов, чтобы гарантировать отсутствие загрязнения образцов. Любое снижение тестовых характеристик ePCR может отрицательно повлиять на результаты нашей модели.

Чтобы быть действительно экономически эффективным, вероятно, потребуется создание региональных центров тестирования для анализа ePCR.Каждое педиатрическое стационарное учреждение будет иметь только небольшое количество образцов, и результаты должны быть доступны в течение 24 часов, чтобы быть клинически значимыми. Путем объединения образцов это число может быть значительно увеличено. Это снизило бы затраты на дублирование обширных мер контроля качества и уменьшило бы дополнительное использование лабораторных площадей и усилий, которые не были учтены в нашей модели. Однако наша модель не учитывает дополнительные затраты на быструю транспортировку образцов в контролируемых условиях.

Во время пикового сезона энтеровирусных инфекций, с июня по октябрь в умеренном климате, количество доступных образцов и распространенность энтеровирусных заболеваний увеличивается. Сосредоточение тестирования на этом сезоне позволит добиться большей экономии за счет масштаба и более точных результатов тестирования. Тестирование с помощью ePCR может принести дополнительную нерасчетную пользу младенцам, получавшим антибактериальную терапию до получения культур спинномозговой жидкости. В нашей исследуемой популяции 4 пациента лечились от бактериального менингита, несмотря на отрицательные результаты посева ЦСЖ, поскольку они получали предварительную обработку антибиотиками.Документированная энтеровирусная инфекция может сократить как продолжительность антибактериальной терапии, так и продолжительность пребывания в больнице у этих младенцев.

Тестирование полимеразной цепной реакции становится все более доступным в клинических условиях. Наша модель поддерживает предположение о том, что универсальное тестирование младенцев с менингитом, поступающих в больницу с менингитом, с помощью ePCR позволит сэкономить средства за счет более ранней выписки. Эта стратегия лечения требует проспективной проверки в клинических условиях с измерением как прямых, так и косвенных затрат и выгод.

Принята к публикации 3 марта 2000 г.

Отпечатки: Лиз Э. Нигрович, доктор медицины, отделение медицины, детская больница, 300 Longwood Ave, Бостон, Массачусетс 02115 (электронная почта: [email protected]).

1. ротбарт
HA Диагностика энтеровирусного менингита с помощью полимеразной цепной реакции. J Pediatr. 1990; 11785-89Google ScholarCrossref 2. Юрист
MHHolland
DAintablian
NConnor
JDKeyser
EFWaecker
Нью-Джерси
Младший. Диагностика энтеровирусной инфекции центральной нервной системы с помощью полимеразной цепной реакции во время крупной вспышки болезни. Pediatr Infect Dis J. 1994; 13177-182Google ScholarCrossref 3.Berlin
ЛЕРОРАБО
MLHeldrich
FRoberts
KDoran
TModlin
JF Асептический менингит у младенцев J Infect Dis. 1993; 168888-892Google ScholarCrossref 4.Rotbart
HA Энтеровирусные инфекции центральной нервной системы. Clin Infect Dis. 1995; 20971-981Google ScholarCrossref 5.Rorabaugh
MLBerlin
LEHeldrich
F
и другие.Асептический менингит у детей младше 2 лет: острые заболевания и неврологические осложнения. Педиатрия. 1993;

-211Google Scholar6.Chonmaitree
TFord
CSanders
CLucia
HL Сравнение культур клеток для быстрого выделения энтеровирусов.

J Clin Microbiol. 1988; 262576-2580Google Scholar7.Lipson
SMWalderman
RCostello
PSzabo
K Чувствительность культур клеток эмбрионов рабдомиосаркомы и морских свинок к полевым изолятам трудно культивируемых вирусов Коксаки группы А. J Clin Microbiol. 1988; 261298-1303Google Scholar8.Yerly
SGervaix
ASimonet
VCaflisch
MPerrin
LWunderli
W Быстрое и точное обнаружение энтеровирусов в образцах от пациентов с асептическим менингитом. J Clin Microbiol. 1996; 34199-201Google Scholar9.Abzug
MJLoeffelholz
MRotbart
HA Диагностика неонатальной энтеровирусной инфекции с помощью полимеразной цепной реакции. J Pediatr. 1995; 126447-450Google ScholarCrossref 10.Ротбарт
HAAhmed
AHickey
S
и другие. Диагностика энтеровирусной инфекции методом полимеразной цепной реакции на нескольких типах образцов. Pediatr Infect Dis J. 1997; 16409-411Google ScholarCrossref 11.Kessler
HHSantner
BRabenau
ЧАС
и другие. Быстрая диагностика энтеровирусной инфекции с помощью нового одноэтапного метода ПЦР с обратной транскрипцией. J Clin Microbiol. 1997; 35976- 977Google Scholar12.Ahmed
ABrito
FGoto
C
и другие.Клиническая ценность полимеразной цепной реакции для диагностики энтеровирусного менингита у младенцев. J Pediatr. 1997; 131393-397Google ScholarCrossref 13.Rotbart
HASawyer
MHFast
S
и другие. Диагностика энтеровирусного менингита с помощью ПЦР с колориметрическим методом обнаружения микролунок. J Clin Microbiol. 1994; 322590-2592Google Scholar14.Marshall
GSHauck
МАБак
Грабале
GP Возможная экономия средств за счет быстрой диагностики энтеровирусного менингита. Pediatr Infect Dis J. 1997; 161086-1087Google ScholarCrossref 15. Гамильтон
МСДжексон
MAAbel
D Клиническая применимость тестирования полимеразной цепной реакции при энтеровирусном менингите. Pediatr Infect Dis J. 1999; 18533-537Google ScholarCrossref 16.Borgbjerg
BMGjerris
FAlbeck
MJBorgesen
SE Риск инфицирования после шунтирования спинномозговой жидкости: анализ 884 первичных шунтов. Acta Neurochir (Вена). 1995; 1361-7Google ScholarCrossref 17.Шольц
HHofmann
TNoack
Награды
DJStoeckel
K Проспективное сравнение цефтриаксона и цефотаксима для краткосрочного лечения бактериального менингита у детей. Химиотерапия. 1998; 44142-147Google ScholarCrossref 18.Byington
CLTaggart
EWCarroll
KCHillyard
DR Эпидемиологическое расследование на основе полимеразной цепной реакции частоты неполиомиелитных энтеровирусных инфекций у детей с лихорадкой и афебрилитетом в возрасте 90 дней и младше. Педиатрия [сериал онлайн]. 1999; 103E27Google Scholar19.Greenes
Д.Г.Харпер
МБ Низкий риск бактериемии у детей с лихорадкой и узнаваемыми вирусными синдромами. Pediatr Infect Dis J. 1999; 18258-261Google ScholarCrossref 20. Купперманн
NBank
DEWalton
EASenac
МО
JrMcCaslin
I Риск бактериемии и инфекций мочевыводящих путей у детей раннего возраста с лихорадкой и бронхиолитом. Arch Pediatr Adolesc Med. 1997; 1511207-1214Google ScholarCrossref

.