In vitro Размножение / дифференциация / созревание дендритных клеток (DC)

После очистки фиколла PBMC помещали в среду RPMI 1640 с добавлением 10% фетальной телячьей сыворотки, 100 Ед / мл пенициллина, 0.1 мг / мл стрептомицина и 1% глутамина (RP10), а через 2 часа не прилипшие клетки удаляли. Прилипшие клетки использовали в качестве исходной популяции и культивировали в среде RP10 с добавлением rhGM-CSF (100 нг / мл) и rhIL-4 (25 нг / мл) в течение 7 дней.

PO растворяли в воде и добавляли к клеткам, растущим в среде RP10, в нескольких конечных концентрациях (1, 10 или 100 мкг / мл). ПО добавляли с 0 по 7 день (незрелые DC, iDC D0). Мы добавили 1 мл свежей среды RP10 с добавлением GM-CSF и IL-4 на 2 день.На 5 день некоторые нДК (нДК D5) обрабатывали различными концентрациями ПО (1, 10 и 100 мкг / мл), чтобы изучить его влияние на созревание нДК. В качестве положительного контроля мы использовали LPS (50 нг / мл) для индукции созревания DC (mDC), а также исследовали влияние PO на LPS-индуцированное созревание. Эксперименты были выполнены в трех экземплярах, и результаты выражены как среднее значение ± стандартная ошибка среднего. Экспрессию молекул клеточной поверхности анализировали через 7 дней культивирования. Окрашивание клеток проводили с использованием флуоресцентно-конъюгированных моноклональных антител.Антитела PE-Cy ™ 5-конъюгированные против CD1a (клон HI149), BV421-конъюгированные против CD83 (клон HB15e), BV605-конъюгированные против CD80 (клон L307.4), BV650-конъюгированные анти-CD14 (клон M5E2), BV711- конъюгированный анти-CD40 (клон 5C3), конъюгированный с PE-Cy ™ 7 анти-CD86 (клон 2331), конъюгированный с Alexa Fluor®647 анти-CCR1 (клон 53504) и Fc-Block были получены от BD Biosciences. Конъюгированные с APC-Alexa Fluor®750 антитела против HLA-DR (клон Immu-357) были приобретены у Beckman Coulter. Человеческое антитело, конъюгированное с флуоресцеином CCR7 (клон 150503), было приобретено у R&D Systems, а антитело к CD1c, конъюгированное с фикоэритрином (РЕ) (клон AD5-8E7), было приобретено у Miltenyi Biotech.Образцы собирали на BD-LSR Fortessa (Becton Dickinson), и все данные анализировали с помощью программного обеспечения FlowJo (Tree Star, Ashland, OR, США). iDC идентифицировали по экспрессии CD1a и CD1c и потере экспрессии CD14, а созревание DC контролировали по экспрессии CD40, CD80, CD83 и CD86 в клетках HLA-DR +.

In vitro Экспансия / активация Т-клеток

Клетки обрабатывали ПО на протяжении всего протокола размножения / активации. Использовали несколько концентраций: PO 1, 10, 100 и 500 мкг / мл.После фиколла мы использовали набор для позитивной селекции EasySep ™ CD3 (StemCell Technologies) в соответствии с протоколом производителя. Очищенные клетки CD3 ⁺ ресуспендировали в RPMI-Glutamax, 10% FBS. Клетки активировали человеческим Т-активатором CD3 / CD28 Dynabeads (Life Technologies) согласно протоколу производителя. На 5 день мы проанализировали пролиферацию Т-клеток и различные маркеры Т-клеток. Некоторые образцы обрабатывали PMA (50 нг / мл) / иономицином (1 мкг / мл). Внутриклеточное окрашивание выполняли путем добавления BD GolgiPlug, ингибитора транспорта белков, содержащего брефельдин A (BD Biosciences).

Экспрессию молекул клеточной поверхности анализировали через 7 дней культивирования. Окрашивание клеток проводили с использованием флуоресцентных конъюгированных мышиных моноклональных антител. V500-конъюгированные анти-CD4 (клон L200), PerCP-Cy5.5-конъюгированные анти-CD25 (клон MA251), V450-конъюгированные анти-Foxp3 (клон 259D / C7), PE-конъюгированные анти-CD127 (клон HIL7RM21), PE-Cy7- конъюгированные антитела против IFN-g (клон B27) и конъюгированные с PerCP-Cy5.5 антитела против IL-17a были получены от BD Biosciences. PB-конъюгированные анти-CD4 (клон 13B8.2) и АРС-конъюгированные антитела к CD8 (клон B9.11) были приобретены у Beckman Coulter. Окрашенные образцы анализировали на проточном цитометре Gallios (Beckman Coulter) с использованием программного обеспечения Kaluza. Эксперимент проводили в трех экземплярах, и результаты выражали как среднее значение ± стандартная ошибка среднего.

Расширение и активация человеческих NK-клеток

Это было выполнено, как описано ранее (14). Вкратце, единицы крови были истощены по Т-клеткам с использованием набора для позитивной селекции EasySep ^TM CD3 (STEMCELL Technologies).Клетки культивировали в течение 20 дней с γ-облученными клетками PLH при соотношении NK-клетки: дополнительные клетки 1: 1 в присутствии IL-2 (100 Ед / мл) и IL-15 (5 нг / мл). Клетки PLH добавляли каждые 4 дня, а свежие цитокины — через день. Мы не добавляли ЛЖВ в течение последних 4 дней, и в конце процесса чистота NK-клеток (CD56 ⁺ / CD3 ^–) всегда была выше 90% без оставшихся живых клеток ЛЖ.

Для фенотипического анализа клетки окрашивали 7AAD (Beckman Coulter) для идентификации жизнеспособных клеток и антител против поверхностных маркеров.FITC-конъюгированные анти-CD25 (клон B1.49.9), анти-CD45RO (клон UCHL1), PE-конъюгированные анти-CD69 (клон TP1.55.3), анти-CD62L (клон DREG56), анти-CD19 (клон J3-119), анти-CD3 ( клон UCHT1), ECD-конъюгированный анти-CD19 (клон J3-119), конъюгированный с PacificBlue анти-CD16 (клон 3G8), анти-CD57 (клон NC1), APC-AlexaFluor750-конъюгированный анти-CD45 (клон J33), анти-CD45RA (клон 2h5LDh21LDB9 ), Анти-CD45, конъюгированный с KromeOrange (клон J33), и анти-CD16 (клон3G8) были получены от Beckman Coulter. FITC-конъюгированные анти-CD158b (клон CH-L), PE-конъюгированные анти-CD158a (клон HP-3E4) и V450-конъюгированные анти-CD107a (клон h5A3) были предоставлены BD Biosciences.APC-конъюгированные анти-CD56 (клон REA196), анти-CD3 (клон AC146) и Vioblue-конъюгированные анти-CD158e (клон DX9) были приобретены у Miltenyi. Конъюгированные с PECy7 анти-CD56 (клон HCD56) были получены от BioLegend. 1 × 10 ⁵ -3 × 10 ^{5 клеток} инкубировали в течение 20–30 мин при 4 ° C с различными антителами в PBS, содержащем 2,5% FBS. Затем клетки промывали и суспендировали в 200–250 мкл той же среды. Окрашенные образцы анализировали на проточном цитометре Gallios (Beckman Coulter) с использованием программного обеспечения Kaluza.Жизнеспособные лимфоциты регистрировали с использованием окрашивания FSC / SSC и 7AAD. В-клетки (CD19 ⁺ ), Т-клетки (CD3 ⁺ CD56 ^—) и NK-клетки (CD56 ⁺ CD3 ^—) были выделены с использованием антител к CD19, CD3 и CD56 соответственно.

Цитотоксичность, опосредованная NK-клетками

Это выполняли, как описано ранее (14, 15). NK-клетки метили 3 мкМ красителя CellTracker ™ Violet BMQC (Life Technologies) и инкубировали в течение ночи с клетками-мишенями при различных соотношениях E: T.Впоследствии транслокация фосфатидилсерина (PS) и повреждение мембраны были проанализированы в популяции клеток-мишеней с отрицательной флуоресценцией с помощью проточной цитометрии с использованием аннексина V-FITC (Immunostep) и 7AAD (BD Biosciences) или йодида пропидия (PI), как описано ранее (16, 17). Мы считаем все клетки, положительные по аннексину-V и / или PI (или 7-ADD), мертвыми (или умирающими).

NK Degranulation Assay

Это было сделано, как описано ранее (15). Вкратце, 50 × 10 ³ клеток-мишеней на лунку помещали в RPMI, 10% FBS, IL-2 100 Ед / мл с монензином (BD Biosciences) в 96-луночный планшет с V-образным дном.NK и клетки-мишени инкубировали в течение ночи при 37 ° C в 5% CO ₂ и подсчитывали живые клетки, используя цитометр Muse (Millipore) с набором для подсчета и жизнеспособности (Millipore). В качестве контроля NK-клетки инкубировали без клеток-мишеней. NK-клетки CD107a ⁺ анализировали на проточном цитометре Gallios (Beckman Coulter) с использованием 7AAD, CD45RO-FITC, CD19-PE, CD56-PECy7, CD3-APC, CD45RA-APCAlexaFluor750, CD16-KromeOrange и CD107a-HV500 (B Биологические науки). Результаты были проанализированы с помощью программы Kaluza.

Статистический анализ

Экспериментальные значения обрабатывали и статистический анализ выполняли с использованием программного обеспечения GraphPad Prism (v6.0). Все статистические данные представлены как * p <0,05; ** p <0,01; *** p <0,001 и **** p <0,0001. Средние значения выражаются как среднее плюс или минус стандартная ошибка среднего (SEM).

Результаты были получены от трех индивидуальных доноров «Etablissement français du sang» ( EFS ).Мы подготовили по три биологических образца из каждой лейкоцитной пленки для каждого из следующих экспериментов: концентрация PO и тип клеток.

Результаты

Эффекты перорального введения у пациентов с раком молочной железы

Мы выбрали когорту из 20 пациенток со средним возрастом 53,5 года (диапазон 32–78). Первая биопсия в день O показала, что у них были разные оценки TNM и что у большинства была инфильтративная протоковая карцинома (). Мы лечили пациентов внутримышечно перорально в течение 1 недели и получили вторую биопсию на 8-й день.Среди пациентов шесть продемонстрировали патологические изменения после операции по сравнению с результатами до операции (). Пациенты, ответившие на лечение, имели различные показатели TNM, рецепторы эстрогена и прогестерона, окрашивание Her2 / neu и индексы пролиферации (). Один пациент имел особенно агрессивный тройной отрицательный фенотип, т.е. отрицательный по рецепторам эстрогена, прогестерона и фактора роста эпидермиса 2 человека (HER2), и имел высокий индекс пролиферации, измеренный с помощью высокого коэффициента пролиферации на основе Ki-67 окрашивание ().Получила пероральную терапию в течение 1 недели, перенесла радикальную мастэктомию левой груди с сохранением грудных мышц. В послеоперационном материале наблюдали патоморфоз 4 степени (). Это соответствует полному исчезновению инфильтрата опухолевых клеток, что означает полный патологический ответ. Мы также наблюдали воспалительный инфильтрат в ложу опухоли (), который состоял из клеток как клеточного, так и гуморального иммунитета с почти эквивалентным соотношением Т- и В-клеток (). Макрофаги состояли из отдельных гистиоцитов, сгруппированных в гранулемы, и демонстрировали появление гигантской клеточной реакции ().Наконец, около 15–20% инфильтрирующих клеток были гранулоцитами, в основном нейтрофилами (данные не показаны). Таким образом, изменения, выявленные после лечения ПО у этого пациента, соответствовали активному хроническому воспалению с образованием гранулемы.

Таблица 2

Клиническая характеристика пациентов с патоморфозом после лечения ПО (вверх), а также рецепторный статус и индекс пролиферации их опухолей (вниз).

9025 2

9025 2

9025 2 9025 2

9025 2

0253

0253

Гистологические паттерны при постановке диагноза 32-летнего пациента с тройным отрицательным ответом, достигшего полного патологического ответа после лечения ПО. (A) Морфологические признаки при окрашивании гематоксилин-эозином (H-e) (x50) показали инфильтрат протоковой опухоли. (B) Иммуногистохимическое окрашивание показало тройную отрицательность в отношении рецептора прогестерона (PR), рецептора эстрогена (ER) и рецептора роста эстрогена 2 человека (HER2) с высоким индексом Ki-67.

Гистологические картины после введения полиоксидония (ПО) 32-летнему пациенту с тройным отрицательным результатом, достигшим полного патологического ответа после лечения. (A) Морфологические аспекты, с наличием гранулемы, воспалительного инфильтрата и фиброза ткани, без инфильтрата опухолевых клеток (H-e; x20). (B) Иммуногистохимическое исследование с использованием антител к панцитокератину (AE1 / AE3) с последующим окрашиванием гематоксилином по Майеру. Положительный результат был ограничен только протоками молочной железы без инфильтрата опухолевых клеток, что соответствовало полному патологическому ответу. (C) Иммунный инфильтрат наблюдался в срезах биопсии с иммуногистохимическим окрашиванием послеоперационного материала.Наблюдались Т-лимфоциты (CD3, CD4, CD8-положительные клетки), B-лимфоциты (CD20-положительные клетки) и макрофаги (CD68-положительные клетки).

Кроме того, незначительные изменения (степень 1) наблюдались у трех пациентов, а уменьшение инфильтрата опухоли (степень 2) было обнаружено у двух пациентов. Мы также получили клеточные суспензии и изучили субпопуляции лейкоцитов, инфильтрирующих опухоль. Мы обнаружили значительную разницу в популяции CD4 ⁺ на инфильтрате опухолевых клеток между шестью пациентами с патологическими изменениями и пациентами без патологических изменений, соответственно 50.91 ± 2,05% против 40,89 ± 2,26% ( P = 0,006). Кроме того, соотношение CD8 / CD4 составляло 0,79 ± 0,09 против 1,17 ± 0,13 ( P = 0,03). Мы также проанализировали субпопуляции CD4 и CD8 в крови и аспиратах костного мозга девяти наших пациентов на день 0 и на 8 день после лечения перорально и не обнаружили каких-либо значимых различий (данные не показаны).

Эффекты ПО в Т-клетках

Предыдущие результаты, касающиеся рекрутирования Т-клеток, побудили нас исследовать прямое влияние ПО на Т-клетки.Мы стимулировали очищенные Т-клетки от трех здоровых доноров (HD) антителами к CD3 / CD28. Этот протокол индуцировал эффективную активацию, что измерялось по подавлению CD127 и положительной регуляции CD25 (дополнительная фигура 1A) и подавлению CD45RA (данные не показаны). Чтобы частично имитировать относительно длительное лечение PO у пациентов с раком груди, мы стимулировали Т-клетки и лечили их различными концентрациями PO. Количество Т-клеток статистически увеличивалось к 5-му дню при 100 и 500 мкг / мл (). Напротив, PO не изменяет ни процент клеток CD4 ⁺ , экспрессирующих CD127, CD25 и CD45, ни уровень их экспрессии (дополнительный рисунок 2).Точно так же ПО не влияло на активацию CD8 ⁺ , за исключением того, что снижение уровней CD25 было вызвано более высокими дозами ПО (дополнительная фигура 3). Рестимуляция Т-клеток на 5-й день с помощью PMA / иономицина индуцировала продукцию IFNγ в обоих компартментах Т-клеток. На этот ответ не повлиял РО (дополнительный рисунок 3). Таким образом, хроническое лечение in vitro PO не оказывало токсического действия и, фактически, увеличивало пролиферацию Т-клеток без отрицательного воздействия на любой из протестированных маркеров активации.

PO увеличивает пролиферацию Т-клеток. Очищенные Т-клетки от трех отдельных здоровых доноров активировали костимуляцией против CD3 / CD28 в трех повторностях. Указанные концентрации ПО добавляли в день 0. Количество клеток определяли количественно. Среднее количество контрольных необработанных клеток было стандартизовано до 1, чтобы уменьшить вариабельность между донорами. Графики представляют собой средние значения ± SEM; ** p <0,01, *** p <0,001; Тест ANOVA использовали для сравнения с необработанными клетками.

Эффекты ПО на дендритные клетки (ДК)

ДК являются ключевыми регуляторами иммунных ответов, способными примировать наивные покоящиеся Т-клетки и инициировать первичные Т-клеточные ответы. Следовательно, влияние ПО на Т-клетки у пациентов с раком груди может быть опосредовано модуляцией постоянного тока. Мы обрабатывали адгезивные клетки PBMC колониестимулирующим фактором гранулоцитов-макрофагов (GM-CSF) и интерлейкином-4 (IL-4) в течение 5 дней для образования незрелых DC (iDC) и способствовали их созреванию (mDC) еще на 2 дня. инкубация с липополисахаридом (ЛПС).Мы проанализировали влияние ПО на генерацию и созревание постоянного тока с использованием трех протоколов. Во-первых, мы добавили несколько концентраций PO с 0 по 7 день. Это указывает на способность PO влиять на образование / распространение iDC. Во-вторых, мы лечили нДК перорально на 5-й день (D5). Это позволило нам отслеживать способность ПО индуцировать созревание iDC per se , таким образом указывая, способствует ли ПО формированию гуморального и / или клеточно-опосредованного иммунного ответа. В-третьих, мы созрели iDC с LPS, одновременно обрабатывая клетки несколькими концентрациями PO.Это исследует способность ПО влиять на созревание ЛПС-индуцированного ДК. iDC были идентифицированы по экспрессии CD1a и CD1c и потере экспрессии CD14. Созревание DC контролировали по экспрессии костимулирующих молекул CD40, CD80, CD83 и CD86 в клетках HLA-DR +. Процент нДК, которые экспрессировали костимулирующие молекулы CD80, CD86, CD40 и CD83, был относительно низким и значительно увеличивался в LPS-индуцированных мДК (дополнительный рисунок 4).

PO не влиял на жизнеспособность iDC и mDC и увеличивал образование iDC и mDC при добавлении 100 мкг / мл в день 0 ().Напротив, при добавлении на 5-й день в дозах 1 и 10 мкг / мл он немного снизил жизнеспособность DC (для HD3) и, следовательно, окончательный подсчет (). Мы наблюдали вариабельность между донорами, но ПО неизменно хорошо переносилось с точки зрения жизнеспособности и размножения DC (дополнительный рисунок 5). Взятые вместе, эти результаты предполагают, что ПО может улучшить распространение mDC. Следовательно, в участках воспаления, где происходит созревание DC, PO может способствовать продукции mDC.

Влияние PO на жизнеспособность и расширение DC.Количество клеток (справа) и их жизнеспособность (слева), полученные на 7 день от трех отдельных здоровых доноров. Различные концентрации PO (1, 10 и 100 мкг / мл) добавляли либо в день 0 (iDCs D0), либо в день 5 (iDCs D5). Созревание DC (mDC) индуцировали добавлением LPS (50 нг / мл) в отсутствие или в присутствии различных концентраций PO. Из-за изменчивости между донорами мы нормализовали расширение, присвоив разложению iDC значение 1 и скорректировав другие значения до этого числа. Графики представляют собой средние значения ± SEM; * р <0.05, ** р <0,01, *** р <0,001; U Манна-Уитни использовали для сравнения с необработанными клетками.

Затем мы выполнили фенотипический анализ на D7, чтобы оценить уровень экспрессии HLA-класса II и костимулирующих молекул CD40, CD80, CD83 и CD86 (дополнительный рисунок 4). Экспрессия этих поверхностных маркеров увеличивается во время созревания DC и может свидетельствовать об иммуногенных свойствах PO. ПО не влияло на экспрессию любого из этих маркеров во время генерации iDC с точки зрения процента положительных клеток () или уровней экспрессии ().Добавление 10 мкг / мл перорально на 5 день увеличивало процент нДК, экспрессирующих некоторые костимулирующие молекулы, у двух из трех доноров (). Более того, такая же концентрация PO увеличивала уровни экспрессии некоторых костимулирующих молекул у этих пациентов (). Это показывает, что ПО обладает иммуногенными свойствами. ПО не изменяет LPS-индуцированную экспрессию костимулирующих молекул (дополнительные рисунки 4, 6). Фактически, увеличение, вызванное LPS, уже было очень высоким, что позволяет предположить, что PO не может увеличивать его дальше.

Влияние РО на процент ДК, экспрессирующих маркеры созревания ДК. iDC были индуцированы, как описано в заголовке. (A) Процент DC, экспрессирующих различные маркеры. (B) Анализировали уровни экспрессии (MFI) маркеров созревания DC. Графики представляют собой средние значения ± стандартная ошибка среднего для каждого отдельного здорового донора с биологическими экспериментами, выполненными в трех биологических повторностях. * p <0,05, ** p <0,01; U-критерий Манна-Уитни использовали для сравнения с необработанными клетками.

Наконец, для проверки созревания ДК, индуцированного ПО, обработанные ПО ДК культивировали совместно с Т-клетками, меченными CFSE, для оценки их способности индуцировать пролиферацию аллогенных CD4 и CD8 Т-клеток. Мы использовали незрелые и зрелые DC в качестве контроля. Во-первых, важно отметить, что пролиферация как CD4, так и CD8 Т-клеток индуцировалась во всех условиях, испытанных в трех независимых биологических экспериментах для двух отдельных доноров.

Повышенное количество пролиферирующих Т-клеток наблюдалось после инкубации с мДК у обоих доноров.Инкубация с iDC, обработанными PO, увеличивала пролиферацию аллогенных CD4 и CD8 T-клеток по сравнению с контрольными iDC (). Хотя эти результаты различались у разных доноров, они продемонстрировали хорошую иммуногенность ДК, обработанных ПО, и их способность индуцировать пролиферацию CD4 и CD8 Т-клеток.

PO увеличивает потенциал iDC для стимуляции реакции смешанных лимфоцитов (MLR). iDC, обработанные в D5 различными концентрациями PO (0, 1, 10, 100 мкг / мл) или mDC, как описано в заголовке, использовали для стимуляции CFSE-меченных аллогенных Т-клеток при соотношении DC: T-клетки. из 1:40. (A) Пролиферацию Т-клеток анализировали на 5 день. Все условия тестировали, по крайней мере, в трех повторностях. На рисунке представлены репрезентативные точечные графики (вверху) и гистограммы, изображающие пролиферацию аллогенных клеток CD4 ⁺ , меченных CFSE, и клеток CD8 ⁺ , меченных CFSE (внизу). (B) Процент высоко пролиферирующих клеток CD4 (вверху) и CD8 (внизу). * p <0,05, ** p <0,01, *** p <0,001, **** p <0.0005; Mann-Whitney U использовали для сравнения с необработанными клетками.

В заключение, ПО не влияет на дифференцировку ДК, но может способствовать их созреванию и экспрессии костимулирующих молекул, что приводит к хорошей иммуногенности ДК, отражаемой пролиферацией Т-клеток. Однако существует вариабельность, предполагающая, что эффекты перорального введения могут зависеть от иммунного статуса пациента / донора.

Эффекты ПО на NK-клетки

NK-клетки являются частью врожденной иммунной системы и обладают естественной цитотоксичностью.NK-клетки преимущественно нацелены на клетки, лишенные MHC-I, включая трансформированные или инфицированные вирусом клетки, которые подавляют экспрессию MHC-I, чтобы избежать распознавания CTL. Следовательно, гипотеза «отсутствующего« я »» предполагает, что NK-клетки отличают клетки-мишени от других здоровых «собственных» клеток на основе экспрессии MHC-I. Однако теперь ясно, что активация NK-клеток зависит от сложного процесса передачи сигналов, опосредованного активирующими и ингибирующими рецепторами. Результат зависит от силы различных активирующих и тормозящих сигналов.Ингибирующие рецепторы в основном распознают молекулы MHC-I (HLA у людей), а активирующие рецепторы могут распознавать стрессовые лиганды в клетках-мишенях. Следовательно, NK-клетки также устраняют «стрессовые» клетки, даже если они экспрессируют нормальные уровни MHC-I.

Поскольку NK-клетки обеспечивают противораковую защиту (18, 19), мы проанализировали влияние PO на активацию и экспансию NK-клеток. Клетки PBMC, истощенные по CD3 ⁺ , инкубировали при различных концентрациях PO, и количество клеток анализировали на 7, 14 и 21 день.Мы наблюдали снижение количества только при концентрациях 500 мкг / мл, но эффект не отличался статистически при любой концентрации (дополнительный рисунок 7). Фактически, необработанные данные были очень разнородными из-за различий в исходном количестве NK-клеток в мешках с кровью и реакции на протокол активации / расширения. Это было ожидаемо, учитывая различный процент NK-клеток у здоровых людей (примерно 5–20%) и ответы NK-клеток на различные стимулы (14). Чтобы противодействовать этой проблеме, мы рассчитали среднее количество клеток для каждого донора и получили нормализованное значение.Мы использовали это для нормализации значений в клетках, обработанных PO. Это показало, что ПО при 500 мкг / мл снижает пролиферацию NK-клеток (). Напротив, более низкие концентрации не оказали никакого эффекта. Следовательно, ПО не влияет на жизнеспособность и пролиферацию NK-клеток при концентрациях ниже 100 мкг / мл и до 21 дня стимуляции, что позволяет предположить, что эти концентрации не должны отрицательно влиять на жизнеспособность и пролиферацию NK-клеток у пациентов. В этом контексте следует отметить, что периферические NK-клетки имеют короткую продолжительность жизни, в среднем 1 неделю (20), поэтому маловероятно, что большинство NK-клеток будут контактировать с PO в течение более длительных периодов.

Высокая концентрация PO снижает пролиферацию NK-клеток. NK-клетки от трех отдельных здоровых доноров были активированы костимуляцией клетками-мишенями и низкими дозами цитокинов в течение различных периодов времени. В день 0 добавляли различные концентрации PO и определяли количество клеток. Средние контрольные значения были стандартизированы до 1, чтобы уменьшить вариабельность между донорами. Графики представляют собой средние значения ± SEM; * p <0,05, ** p <0,01, *** p <0.001; Тест ANOVA использовали для сравнения с необработанными клетками.

Затем мы исследовали эффекты ПО на три хорошо известных маркера активации NK-клеток, CD69, CD25 и рецептор трансферрина CD71, на 21 день после активации (дополнительная фигура 8A). CD71 активируется в клетках с высоким метаболизмом. CD25 — это рецептор IL-2 с высоким сродством. CD69 является маркером NK ранней активации. Все эти маркеры были увеличены после активации NK-клеток, и их экспрессия была выше в NK с высокой противораковой активностью (21, 22).Ни одна из концентраций PO не влияла на процент NK-клеток, экспрессирующих CD69 и CD71, или на их уровни экспрессии, измеренные по интенсивности MFI. Мы наблюдали тенденцию к увеличению процента CD25-положительных клеток и более высоких уровней CD25 при PO 10 мкг / мл. Однако обычно ПО не изменяет экспрессию этих маркеров активации.

Во время созревания NK-клеток клетки CD56 ^bright становятся CD56 ^dim CD62L ⁺ CD57 ^— клеток, которые продуцируют перфорин, сохраняя при этом высокую продукцию IFN-γ в ответ на цитокины (23, 24).CD56 ^dim CD62L ^— Клетки CD57 ⁺ затем демонстрируют низкий ответ на цитокины и более высокую цитотоксическую способность и считаются полностью зрелыми NK-клетками (23, 25). In vitro стимулы на период до 20 дней не индуцируют CD57 (14). PO при 10–100 мкг / мл продемонстрировал тенденцию к снижению экспрессии обоих маркеров (дополнительная фигура 8B). Наконец, полностью зрелые цитотоксические NK-клетки экспрессируют ингибирующие иммуноглобулиноподобные рецепторы киллерных клеток (KIR) и CD16 (26).Дополнительная фигура 8B показывает тенденцию к увеличению экспрессии KIR и отсутствие изменений CD16 в клетках, обработанных PO (до 100 мкМ).

Цитотоксическая функция NK-клеток опосредуется активацией рецепторов, например, NKG2D, который распознает стрессовые лиганды в клетках-мишенях. Их взаимодействие вызывает естественную цитотоксичность. Кроме того, NK-клетки распознают домены Fc в мишенях, опсонизированных мАт, с помощью FcγRIIIa (CD16a). Включение вызывает антителозависимую клеточно-опосредованную цитотоксичность (ADCC). ПО в дозах ниже 500 мкМ не влияло на экспрессию этих основных рецепторов (дополнительная фигура 8B).

CD45 — это белок тирозинфосфатаза, который специфически экспрессируется в лейкоцитах (27). Самая большая изоформа CD45RA экспрессируется на «наивных» Т-клетках. Активированные Т-лимфоциты и Т-лимфоциты памяти экспрессируют самую короткую изоформу CD45, CD45RO, в которой отсутствуют экзоны RA, RB и RC. Эта кратчайшая изоформа способствует активации Т-клеток. Экспрессия изоформ CD45 придает NK-клеткам различные функциональные свойства (22). NK-клетки, коэкспрессирующие длинные (CD45RA) вместе с короткими (CD45RO) изоформами, проявляют более высокую противоопухолевую активность у больных гематологическим раком (21).После стимуляции in vitro CD45RA + представляют собой клетки в состоянии покоя, CD45RO + активированы, CD45RARO проявляют более высокую цитотоксичность, а CD45RAdim представляют собой клетки в процессе активации. ПО не оказало значительного изменения в этих популяциях, генерируемых in vitro (дополнительная фигура 9), хотя наблюдалась тенденция к снижению экспрессии CD45RA и к увеличению CD45RO, что могло отражать повышенную цитолитическую активность (22).

Затем мы проанализировали влияние ПО на цитотоксическую функцию, опосредованную NK-клетками, исследуя естественную цитотоксичность и дегрануляцию.Мы использовали два соотношения эффектор: мишень (E: T) 1: 1 и 1: 3. Поскольку более 50% NK-клеток экспрессируют KIR, мы использовали в качестве мишеней первичные клетки, экспрессирующие молекулы MHC-I, которые могут ингибировать KIR-экспрессирующие NK-клетки. Анализ исходных данных не показал изменений ни в одном из этих параметров (дополнительный рисунок 10). Фактически, между донорами была большая неоднородность. Следовательно, мы использовали тот же подход, что и в, для измерения средней цитотоксичности в контрольных клетках для каждого донора и получения соответствующих нормированных значений.Мы использовали их для расчета нормализованных значений для клеток, обработанных PO. Существенных изменений цитотоксичности мы не обнаружили (). Когда мы анализировали дегрануляцию, мы наблюдали тенденцию к усилению ответа при РО 10 мкМ при обоих соотношениях E: T. В заключение, ПО не влияет на цитотоксичность, хотя может способствовать дегрануляции NK.

PO не влияет на цитолитическую функцию NK-клеток. NK-клетки от трех отдельных здоровых доноров были активированы костимуляцией клетками-мишенями и низкими дозами цитокинов в течение 21 дня.Различные концентрации PO были добавлены в день 0. Верхние графики представляют токсичность против опухолевых клеток от пациента с В-клеточной лимфомой при двух различных соотношениях эффектор: мишень (E: T). Нижние графики представляют процент клеток CD107 ⁺ . Средние контрольные значения были стандартизированы до 1, чтобы уменьшить вариабельность между донорами. Графики представляют собой средние значения ± SEM; Тест ANOVA использовали для сравнения с необработанными клетками.

Обсуждение

Стимуляция противоопухолевой активности иммунной системы становится основным клиническим подходом.Последние достижения в онкологии позволяют предположить, что использование клинических молекул, стимулирующих иммунную систему против инфекционных заболеваний различного происхождения, является альтернативой традиционной химиотерапии (1, 4). Посторонние природные полиэлектролиты (белки, полисахариды, нуклеиновые кислоты) и их структурные аналоги (полипептиды, полинуклеотиды) обладают антигенными свойствами и могут служить иммуностимуляторами (5). Синтетические полиэлектролиты (SPE) обладают тем преимуществом, что не являются иммуногенными, а N-оксидные группы PO снижают присущую полиаминам токсичность.Это было проверено во многих клинических условиях (5, 6). Следовательно, PO является явным кандидатом для тестирования в терапии рака. Это была наша первая цель, и результаты обнадеживают: 6 из 20 пациентов ответили на лечение, в основном путем набора клеток CD4 ⁺ в место опухоли. Однако важно понимать механизм действия новых лекарств, а влияние ПО на лимфоциты в основном неизвестно. Мы провели исследовательское исследование, чтобы попытаться определить молекулярную основу его клинического эффекта.

Хотя ПО предпочтительно связывается с миелоидными клетками, он также связывается с лимфоцитами, хотя и с более низким сродством (7). Поэтому мы изучили эффекты PO in vitro на трех подгруппах иммунных клеток, участвующих в противоопухолевых иммунных ответах (10). Поскольку фармакология ПО в основном была неизвестна, мы использовали несколько концентраций. Более того, поскольку мы не знали, в каких функциях может участвовать ПО, мы исследовали его активность в нескольких контекстах, то есть активации, созревания и пролиферации, для каждого проанализированного типа клеток, т.е.е., NK, T и DC.

Хотя мы проанализировали только три HD, мы выявили, что ПО была иммуногенной, и наблюдали большую вариабельность: один давал относительно сильный ответ, один — умеренный, а третий в основном не отвечал. Это напоминало наши наблюдения у пациентов с раком груди, у ~ 30% респондентов. Следовательно, хотя цель этого исследования не состояла в том, чтобы выявить процент пациентов, которые отвечают на лечение перорально, мы полагаем, что наши результаты показывают, что эффект перорального введения зависит от пациента / донора.Этот относительно низкий процент пациентов, ответивших на лечение, встречается в большинстве видов иммунотерапии (28) и не исключает его использования, в основном из-за его низкой токсичности. Новые препараты обычно не работают в клиниках из-за низкого эффекта и / или высокой токсичности (29). Процент пациентов, «ответивших» на лечение, сильно варьируется. Это более примечательно в иммунотерапии, потому что клетка-мишень может модулировать или модулироваться другими или окружающей средой (28). Например, антитела, блокирующие взаимодействие PD-1 / PD-L1, считаются одним из самых больших достижений в лечении рака за последние 20 лет.Однако эта терапия улучшает прогноз только у 50% пациентов с опухолями с лучшим ответом. Для опухолей с низким уровнем ответа процент уменьшается ниже 5%, даже если пациенты экспрессируют PD-L1 (28). Независимо от механизма действия и прямого воздействия ПО на лимфоциты, примечательно то, что этот препарат практически не токсичен для этих клеток при концентрациях до 100 мкг / мл или даже 500 мкг / мл для Т-клеток. Это наблюдалось даже при лечении лимфоцитов в течение нескольких недель. Более того, он не влияет на активацию лимфоцитов in vitro .Следовательно, наши результаты in vitro и in vivo предполагают, что ПО является безопасным продуктом.

Наши результаты показывают, что ПО не оказывает «большого» воздействия на типы клеток и механизмы, которые мы исследовали. Обычно это наблюдается, когда адъюванты используются отдельно (30), и, хотя эффекты ПО незначительны, они когерентны. Например, мы наблюдали эффективную активацию нескольких маркеров активации DC при определенных концентрациях PO (), что коррелировало с лучшей активацией аллогенных Т-клеток ().Следовательно, DC явно активируются лучшими иммуногенными концентрациями PO. Во-вторых, мы наблюдали, что ПО значительно увеличивало экспансию Т-клеток in vitro при двух более высоких концентрациях, тогда как разрастание другой линии лимфоцитов, то есть NK, не было затронуто или уменьшено. Примечательно, что это коррелировало с привлечением CD4 ⁺ Т-клеток к месту опухоли у пациентов с раком груди.

Эффекты ПО не зависели от дозы. Это заставило нас использовать несколько концентраций в нескольких условиях, чтобы выявить те условия, которые демонстрируют иммуногенность.Фактически, отсутствие дозозависимого эффекта не является чем-то необычным для иммунной системы, где чрезмерно сильная иммунная активация может привести к ингибированию клеток. В лимфоцитах двухфазные ответы зависят от фосфатазы CD45, которая дефосфорилирует ингибирующие остатки Src-киназ и приводит к размножению и активации лимфоцитов. Однако сильная активация CD45 приводит к дефосфорилированию активирующих остатков Src-киназ, что ингибирует активацию Т-клеток (31). Следовательно, чрезмерно сильные активирующие сигналы могут эффективно приводить к нарушению активации лимфоцитов.Кроме того, наивные и активированные лимфоциты экспрессируют разные изоформы CD45, которые обладают разной активностью (22, 32). Следовательно, активированные и наивные лимфоциты по-разному реагируют на одни и те же стимулы.

Следовательно, раскрытые нами мишени PO-клеток могут объяснить переменную реакцию на этот полиамин. Таким образом, хотя ПО показало свою клиническую ценность в нескольких ситуациях, будущая работа должна четко установить, какие больные раком могут получить пользу от лечения ПО для улучшения его клинического применения.

Это первое исследование, демонстрирующее как клиническую, так и биологическую активность ПО в области иммунотерапии рака. В этом контексте очень интересно, что две пациентки, которые лучше ответили на ПО, полный патологический ответ и частичный ответ, страдали тройным отрицательным раком груди. Этот тип имеет плохой прогноз (33), и использование PO может улучшить его.

Заявление о доступности данных

Все наборы данных, созданные для этого исследования, включены в статью / дополнительные материалы.

Заявление об этике

Исследования с участием людей были рассмотрены и одобрены N.N. Российский онкологический научный центр им. Блохина в Москве. Пациенты / участники предоставили письменное информированное согласие на участие в этом исследовании.

Вклад авторов

CA, MC, PL-P, D-NV, YE, ED-L и Z-YL проводят эксперименты in vitro . PL-P, JH, J-FR и MVi разрабатывают эксперименты in vitro и написали рукопись. FS, OC, MVa, IV, YV и NT выполняют клиническую часть, включая сбор образцов и анализ ex vivo образцов от пациентов с раком молочной железы.

Конфликт интересов

Авторы заявляют, что исследование проводилось в отсутствие каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могли бы быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.

Сноски

Финансирование. Работа частично поддержана контрактом между НПО Петровакс (Москва, Россия) и общественной структурой INSERM France. НПО «Петровакс» не принимало участия в разработке, сборе, анализе, интерпретации данных исследования, написании этой статьи или принятии решения о ее публикации для публикации.Эта работа также была поддержана программой PRT-K 2018 (MVi; 2018-021) и Canceropole GSO Emergence (MVi; 2018/2019).

Ссылки

1. Крюгер С., Ильмер М., Кобольд С., Кадилья Б.Л., Эндрес С., Орманн С. и др. . Достижения в иммунотерапии рака 2019 — последние тенденции. J Exp Clin Cancer Res. (2019) 38: 268. 10.1186 / s13046-019-1266-0 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 3. Bowen WS, Svrivastava AK, Batra L, Barsoumian H, Shirwan H. Текущие проблемы разработки адъюванта противораковой вакцины.Exp Rev Vaccines. (2018) 17: 207–15. 10.1080 / 14760584.2018.1434000 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 4. Пауэлл Б.С., Андрианов А.К., Fusco PC. Адъюванты полиионных вакцин: еще один взгляд на соли алюминия и полиэлектролиты. Clin Exp Vaccine Res. (2015) 4: 23–45. 10.7774 / cevr.2015.4.1.23 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 5. Кабанов В.А.
От синтетических полиэлектролитов до полимерных субъединичных вакцин. Pure Appl Chem. (2004) 76: 1659–77. 10.1351 / pac200476091659 [CrossRef] [Google Scholar] 6.Пружинец П., Чирун Н., Свейката А. Профиль безопасности полиоксидония в повседневной практике: результаты поставторизационного исследования безопасности в Словакии. Иммунотерапия. (2018) 10: 131–7. 10.2217 / imt-2017-0116 [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 7. Дьяконова В.А., Дамбаева С.В., Пинегин Б.В., Хаитов Р.М. Изучение взаимодействия иммуномодулятора полиоксидония с клетками иммунной системы человека. Int Immunopharmacol. (2004) 4: 1615–23. 10.1016 / j.intimp.2004.07.015 [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 8. Дамбаева С.В., Мазуров Д.В., Голубева Н.М., Дьяконова В.А., Пинегин Б.В., Хаитов Р.М.Влияние полиоксидония на фагоцитарную активность лейкоцитов периферической крови человека. Russ J Immunol. (2003) 8: 53–60. [PubMed] [Google Scholar] 9. Топтыгина А., Семикина Е., Алиошкин В. Влияние иммунопотенциатора Полиоксидония на цитокиновый профиль и продукцию антител у детей, вакцинированных Приориксом. Arch Physiol Biochem. (2012) 118: 197–203. 10.3109 / 13813455.2012.659669 [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 10. Fessenden TB, Duong E, Spranger S. Командные усилия: естественные клетки-киллеры на первом этапе эстафетной гонки против опухолевого иммунитета.J Immunother Cancer. (2018) 6:67. 10.1186 / s40425-018-0380-4 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 11. Webber C, Gospodarowicz M, Sobin LH, Wittekind C, Greene FL, Mason MD, et al. . Улучшение классификации TNM: результаты 10-летнего непрерывного обзора литературы. Int J Cancer. (2014) 135: 371–8. 10.1002 / ijc.28683 [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 12. Ермилова В.Д., Копосова Т.Л., Муравьева Н.И., Кузьмина ЗВ. [Степень выраженности терапевтического патоморфоза и характер изменения рецепторов эстрогена и прогестерона после лучевой и химиотерапии рака груди].Вопр Онкол. (1985) 31: 69–73. [PubMed] [Google Scholar] 13. Семенова Н.А., Дыдыкина И.Ю., Дедерер Л.Ю., Тихомиров А.Г., Горбунова В.А., Лактионова К.П. и др. . Использование 1H-ЯМР-спектроскопии для прогнозирования эффективности неоадъювантной химиотерапии рака груди. Bull Exp Biol Med. (2000) 130: 701–4. 10.1007 / BF02682110 [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 14. Санчес-Мартинес Д., Альенде-Вега Н., Ореккиони С., Таларико Г., Корнильон А., Во Д. Н. и др.
Расширение аллогенных NK-клеток с эффективной антителозависимой клеточной цитотоксичностью в отношении множественных опухолевых клеток.Тераностический. (2018) 8: 3856–69. 10.7150 / thno.25149 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 15. Во Д. Н., Алексия С., Альенде-Вега Н., Моршхаузер Ф., Хуот Р., Менар С. и др. . Активация NK-клеток и восстановление субпопуляций NK-клеток у пациентов с лимфомой после лечения обинутузумабом и леналидомидом. Онкоиммунология. (2018) 7: e1409322. 10.1080 / 2162402X.2017.1409322 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 16. Aguilo JI, Garaude J, Pardo J, Villalba M, Anel A. Протеинкиназа C-тета необходима для активации NK-клеток и in vivo, для контроля прогрессирования опухоли.J Immunol. (2009) 182: 1972–81. 10.4049 / jimmunol.0801820 [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 17. Санчес-Мартинес Д., Азасета Дж., Мунтаселл А., Агило Н., Нуньес Д., Гальвез Э.М. и др. . Человеческие NK-клетки, активированные лимфобластоидными клетками EBV, преодолевают антиапоптотические механизмы лекарственной устойчивости гематологических раковых клеток. Онкоиммунология. (2015) 4: e991613. 10.4161 / 2162402X.2014.991613 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 18. Вильяльба М., Ратор М.Г., Лопес-Роюэла Н., Кшивинска Е., Гарауде Дж., Альенде-Вега Н.От метаболизма опухолевых клеток до иммунного бегства от опухоли. Int J Biochem Cell Biol. (2013) 45: 106–13. 10.1016 / j.biocel.2012.04.024 [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 19. Анель А., Агило Дж. И., Каталонский Е., Гарауд Дж., Ратор М. Г., Пардо Дж. И др. . Протеинкиназа С-тета (PKC-тета) в функции естественных клеток-киллеров и противоопухолевом иммунитете. Фронт Иммунол. (2012) 3: 187. 10.3389 / fimmu.2012.00187 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 21. Krzywinska E, Allende-Vega N, Cornillon A, Vo DN, Cayrefourcq L, Panabieres C, et al.. Идентификация противоопухолевых клеток, несущих антигены естественных киллеров (NK), у пациентов с гематологическим раком. EBioMedicine. (2015) 2: 1364–76. 10.1016 / j.ebiom.2015.08.021 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 22. Krzywinska E, Cornillon A, Allende-Vega N, Vo DN, Rene C, Lu ZY, et al. . Профиль изоформы CD45 идентифицирует подмножества естественных киллеров (NK) с различной активностью. PLoS ONE. (2016) 11: e0150434. 10.1371 / journal.pone.0150434 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 23.Bryceson YT, Chiang SC, Darmanin S, Fauriat C, Schlums H, Theorell J, et al. . Молекулярные механизмы активации естественных клеток-киллеров. J. Врожденный иммунитет. (2011) 3: 216–26. 10.1159 / 000325265 [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 24. Juelke K, Killig M, Luetke-Eversloh M, Parente E, Gruen J, Morandi B и др. . Экспрессия CD62L идентифицирует уникальное подмножество полифункциональных NK-клеток CD56dim. Кровь. (2010) 116: 1299–307. 10.1182 / blood-2009-11-253286 [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 25. Lopez-Verges S, Milush JM, Pandey S, York VA, Arakawa-Hoyt J, Pircher H, et al.. CD57 определяет функционально отличную популяцию зрелых NK-клеток в субнаборе NK-клеток человека CD56 ^dim CD16 ⁺ . Кровь. (2010) 116: 3865–74. 10.1182 / blood-2010-04-282301 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 26. Abel AM, Yang C, Thakar MS, Malarkannan S. Естественные клетки-киллеры: развитие, созревание и клиническое использование. Фронт Иммунол. (2018) 9: 1869. 10.3389 / fimmu.2018.01869 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 27. Каплан Р., Морс Б., Хюбнер К., Кроче С., Хоук Р., Равера М. и др.. Клонирование трех тирозинфосфатаз человека выявило мультигенное семейство рецептор-связанных протеин-тирозинфосфатаз, экспрессируемых в головном мозге. Proc Natl Acad Sci USA. (1990) 87: 7000–4. 10.1073 / pnas.87.18.7000 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 29. Fogel DB. Факторы, связанные с неудачными клиническими испытаниями, и возможности повышения вероятности успеха: обзор. Contemp Clin Trials Commun. (2018) 11: 156–64. 10.1016 / j.conctc.2018.08.001 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 31.Ри И., Вейлетт А. Протеиновые тирозинфосфатазы в активации лимфоцитов и аутоиммунитета. Nat Immunol. (2012) 13: 439–47. 10.1038 / ni.2246 [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 32. Mustelin T, Vang T, Bottini N.
Белковые тирозинфосфатазы и иммунный ответ. Nat Rev Immunol. (2005) 5: 43–57. 10.1038 / nri1530 [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 33. Liedtke C, Mazouni C, Hess KR, André F, Tordai A, Mejia JA и др. . Ответ на неоадъювантную терапию и долгосрочное выживание у пациентов с тройным отрицательным раком молочной железы.J Clin Oncol. (2008) 26: 1275–81. 10.1200 / JCO.2007.14.4147 [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

Низкодозная вакцина против гриппа Grippol Quadrivalent с адъювантом Полиоксидоний индуцирует гуморальный иммунный ответ, опосредованный T-хелпером-2, и увеличивает активность NK-клеток

Abstract

Грипп вакцина Grippol® Quadrivalent (GQ) — новая вакцина, содержащая адъювант Полиоксидоний® и рекомбинантные гемагглютинины из 4 штаммов вируса гриппа в количестве 5–6 мкг каждого гемагглютинина на дозу для человека.Эти дозы антигенов примерно в 3 раза меньше стандартной дозы, рекомендованной ВОЗ. Мы стремились охарактеризовать иммунный ответ на вакцину GQ и определить вклад адъюванта в этот ответ. Мышей BALB / c вакцинировали GQ или не содержащими адъюванта смесями антигенов (AG). Затем определяли ответ антител, количество Т-клеток памяти в селезенке и функциональные свойства спленоцитов. Было показано, что вакцина GQ индуцирует антитела ко всем 4 гемагглютининам гриппа.Вакцинация GQ вызвала сильное увеличение индуцированной AG пролиферации и продукции цитокинов Th3 ex vivo. Эти эффекты были равны эффекту, достигаемому стандартной дозой антигенов. Вакцинация также вызвала накопление CD4 ⁺ больших лимфоцитов с фенотипом центральных и эффекторных Т-клеток памяти в селезенке. Вакцина GQ усиливала цитолитическую активность естественных киллеров (NK), тогда как смесь AG без адъюванта в пониженных и стандартных дозах не влияла на активность NK.Мы не обнаружили заметного ответа Т-клеток Th2 и CD8 ⁺ на вакцинацию. In vitro вакцина GQ стимулировала созревание дендритных клеток (ДК) человека, происходящих из моноцитов, повышая экспрессию молекул HLA-DR, CD80, CD83, CD86 и ICOSL. Полиоксидоний без АГ также индуцировал экспрессию ICOSL, который играет важную роль в Т-зависимом гуморальном иммунном ответе. Таким образом, вакцина против гриппа GQ с низкой дозой и полиоксидониевым адъювантом является иммуногенной, индуцирует Th3-поляризованный Т-клеточный ответ и созревание Т-клеток памяти CD4 ⁺ , активирует выработку антител к гемагглютининам гриппа и увеличивает активность NK. клетки.

Ключевые слова

Вакцина против гриппа

Адъювант

Азоксимер бромид

Полиоксидоний

Иммунитет

Цитокины

Рекомендуемые статьиЦитирующие статьи (0)

© 2020 Авторы. Опубликовано Elsevier Ltd.

Рекомендуемые статьи

Цитирование статей

Основные этапы развития 3-летних | Разобрался

Три года — большая веха. Дети внезапно превращаются из малышей в дошкольников.Также бывает трудно не ожидать внезапного изменения способностей.

Но дети развиваются по-разному. Третий год не означает, что ребенок получит все
дошкольные навыки
сразу.

Ознакомьтесь с этими этапами развития, чтобы получить представление о том, как обычно развиваются навыки у трехлетних детей.

В этом году дети очень много работают над доработкой мотора
навыки, которые они развили в 2-летнем возрасте
. Они тоже начинают делать что-то новое, особенно с мелкой моторикой (движение мелких мышц).

Большинство трехлетних детей к 4 годам учатся делать подобные вещи:

• Бегать и ходить, не спотыкаясь о собственные ноги

• Прыгать, подпрыгивать и стоять на одной ноге

• Идите назад и поднимайтесь по лестнице одной ногой за другой

• Пинайте и бросайте маленький мяч

• Поймайте большой мяч (большую часть времени)

• Поднимитесь

• Начните крутить педали на трехколесном велосипеде или велосипеде

• Нарисуйте круг мелком, карандашом или маркером

• Играйте с игрушками с маленькими подвижными частями и / или кнопками

• Перелистывайте страницы книги по одной

• Постройте с помощью Mega Bloks и создавайте башни из шести или более блоков

• Рабочие дверные ручки и открытые поворотные крышки для бутылок

В этом году дети начинают думать о мире в новые способы.Вы можете увидеть несколько творческих подходов к решению задач и занятий. К концу этого года дети обычно могут:

• Назовите восемь цветов в коробке с мелками (красный, желтый, синий, зеленый, оранжевый, фиолетовый, коричневый, черный)

• Назовите числа до 10 и начните. подсчет групп вещей

• Начните понимать время в терминах утра, ночи и дней недели

• Вспомните и перескажите любимые истории

• Поймите и поговорите о вещах, которые «одинаковы» и «разные ”

• Следуйте простым трехэтапным инструкциям (« Почистите зубы, умойтесь и наденьте пижаму.»)

• Используйте основные правила грамматики, но делайте ошибки со словами, которые не соответствуют правилам, например, говоря« мыши »вместо« мыши »

• Говорите достаточно хорошо, чтобы большинство незнакомцев понимали они говорят

• Используйте пять или шесть слов в предложении и разговаривайте из двух или трех предложений

• Назовите вам их имя, имя хотя бы одного друга и названия наиболее распространенных предметов

• Понимайте такие слова, как на , на , за и за следующим

• Задавайте вопросы «почему», например «Почему?» чтобы получить больше информации

Социальные и эмоциональные вехи

В этом возрасте дети демонстрируют интересное сочетание независимости, игривости и страха.По мере приближения к 4 годам большинство трехлетних детей делают следующее:

• Интересуются — хотя и колеблются — посещением новых мест и пробованием новых вещей

• Начинают играть с другими детьми (а не только играть бок о бок)

• Начните успокаивать и проявлять заботу о несчастном друге без подсказки

• Играйте по очереди (даже если им это не нравится!)

• Играйте «по-настоящему» жизнь »с игрушками, такими как игровые кухни

• Начните находить простые способы разрешения споров и разногласий

• Покажите (но, возможно, не называйте) различные эмоции, помимо счастья, грусти и безумия

Все дети развиваются на собственное расписание.Но если ребенок приближается к 4 годам и не может делать многие из этих вещей, неплохо было бы выяснить, почему. Родители, учителя и медицинские работники могут работать вместе, чтобы найти ответы.

отзывов о ABCmouse.com для родителей | Common Sense Media

Разочарован. Требуется улучшение.

ABCmouse показалась мне интересной, поэтому я решил зарегистрироваться для своего четырехлетнего сына. Ему очень нравится играть в игры на playstation, iPad и в Интернете (например, Fisherprice, Cartnoon Network).Ему также нравится наша собственная учебная деятельность — мы регулярно выполняем «домашние задания», когда он учится читать и писать слова из четырех-пяти букв, а также играть в математические игры, игры на запоминание и т. Д. Я подумал, что ему понравится этот сайт. Сначала было здорово создать аватар, похожий на него, и наблюдать, как он движется по пути обучения, но это было слишком просто. Итак, я перешел на следующий уровень … все еще слишком просто. ABCmouse, по-видимому, считает, что в математических играх для дошкольников следует считать до 10 и определять числа.Несмотря на это, я позволил ему продолжить уроки. Позже я заметил, что существует довольно много уроков по искусству, что меня просто расстраивало. Я больше, чем кто-либо другой, ценю искусство (у меня степень в искусстве, за то, что кричу громко!), И я не мог этого вынести. Это были раскраски, тонны. У указателя была ужасная задержка для всех сеансов раскраски, и мы с сыном нашли это скучным и утомительным. Может быть, это для некоторых детей, но я не понимаю, как раскраска в линейном искусстве может кого-то чему-то научить. Мой сын считает это рутиной.Почему бы не заняться домашним ремеслом или предложить им посмотреть на настоящее искусство настоящих художников? После завершения «художественной деятельности» это не позволит нам двигаться вперед, если мы не спасем эту чертову штуку. Я настроил действия, чтобы исключить все раскраски, но все же это казалось таким медленным и скучным. Игры так долго загружались, истории были медленными и неинтересными, песни засыпали. Мой совет — сэкономьте деньги, скачайте несколько приложений на планшет или телефон. Если вы не можете этого сделать, посмотрите видео Умизуми в библиотеке и почитайте несколько книг для начинающих.Я не могу сказать достаточно о системе публичных библиотек. Если у вас есть возможность загружать приложения для вашего ребенка, я настоятельно рекомендую для чтения дошкольный ланч-бокс Monkey, Umizoomi Race Around the City для дошкольной математики, любые приложения-головоломки для решения проблем, черт возьми, есть масса ресурсов для держать вашего ребенка в учебе и мотивации. ABCmouse просто не подходит с точки зрения макета сайта, плавной навигации и соответствующих действий, которые будут привлекать внимание дошкольника. Я бы с радостью предложил свои предложения при отмене, но они не предоставили раздел, объясняющий мою проблему, только несколько полей, которые давали вам ОДИН вариант для проверки.Если ABCmouse действительно хочет улучшить свой сайт, им следует отправить опрос или дать родителям раздел для комментариев.

.