Литическая смесь от температуры взрослым и детям: дозировка :: SYL.ru

Высокая температура — это всегда причина для беспокойства, а температура у ребенка, которая не понижается даже под действием лекарств, заслуживает особого внимания. Какими бы ни были причины длительной гипертермии, она может быть опасной. Судорожный синдром у детей и пожилых людей, сильные боли в голове и мышцах, обезвоживание – все это далеко не полный перечень последствий высокой температуры. Привычные лекарства из домашней аптечки не всегда справляются. Чтобы сбить температуру, следует воспользоваться более сильными средствами такими, как литическая смесь от температуры.

Что такое литическая смесь?

Это лекарственное средство, состоящее из различных препаратов и используемое для быстрого снижения температуры и купирования болезненных ощущений. Литическая смесь от температуры – сильный препарат с рядом противопоказаний и побочных эффектов. Кроме этого, смесь может вызывать аллергию, и поэтому нужно всегда проводить следующий тест: капля готовой смеси капается на нижнее веко, и если в течение получаса не появилось раздражений, препарат можно использовать. Раздражение может проявляться самыми разнообразными способами: отек, покраснение, зуд, боль и прочее.

Литическая смесь бывает как в форме таблеток, так и в форме уколов.

Литическая смесь от температуры в таблетках

Главным преимуществом литической смеси в таблетках является то, что в случае появления аллергической реакции желудок больного можно промыть. Однако результат от принятия таблеток появляется позже, чем от уколов. Лекарство начинает действовать только спустя полчаса. Нужную дозу препарата следует растолочь и разбавить водой, а затем давать ребенку. В то же время таблетки анальгина вызывают раздражение слизистой желудка и могут спровоцировать неприятные ощущения.

Литическая смесь от температуры в уколах

Более быстродействующим и эффективным средством являются внутримышечные уколы. Это отличный способ борьбы с лихорадкой, потому что действие инъекций становится заметным уже через четверть часа. Делать инъекцию следует не чаще чем каждые 6 часов, а в идеале — вообще раз в сутки. Застраховаться от возможной аллергической реакции можно при помощи вышеупомянутого метода: в конъюнктивальный мешок закапывается капля препарата. Если никакого жжения, зуда или покраснения нет, значит, нет и аллергической реакции.

Когда используют литическую смесь?

В первую очередь прописывается литическая смесь от температуры. Стоит отметить, что специалисты не рекомендуют сбивать температуру ниже 38.5, кроме некоторых случаев. Например, если у ребенка начались судороги, сильный озноб, сопровождающийся болями в мышцах и суставах, следует принять антипиретик даже при температуре от 37.5.

Литическая смесь актуальна и в тех случаях, когда привычные лекарства, такие как сиропы или свечи, не помогают. Особенно показана литическая смесь от температуры детям, пожилым людям и группам людей, имеющих хронические сердечнососудистые заболевания, а длительная гипертермия способна вызвать их обострение.

Также это средство прописывается в случаях, когда присутствуют симптомы интоксикакии организма, при сильной рвоте и диарее или при похмелье.

Какая рекомендуется дозировка инъекционной смеси для детей?

В зависимости от возраста, веса и тяжести заболевания назначается определенная доза препарата. Ее следует тщательно соблюдать, так как слишком мало смеси не подействует, а злоупотребление препаратом чревато опасными последствиями и ухудшит состояние больного. Литическая смесь от температуры для детей, дозировка которой определена правильно, не способна навредить ребенку.

Чтобы сбить температуру, в составе смеси используется анальгин или метамизол натрия. Дозировка метамизола определяется из расчета 10 мг на 1 кг массы тела. Важно помнить о том, что 1 мл раствора содержит только 500 мг активного вещества.

Вторым компонентом обычно используют 1% димедрол. Препарат обладает гипоаллергенным действием. Вместо него можно использовать супрастин или тавегил. Для ребенка возрастом до года используют 0,1 мл димедрола.

Дозировка раствора папаверина гидрохлорида рассчитывается тем же способом, что и димедрола. Для детей младше одного года используют 0,1 мл раствора. Для детей старше к каждому году ребенка добавляют по 0,1 мл. Препарат обладает спазмолитичным действием и усиливает теплоотдачу, тем самым снижая температуру.

Какая рекомендуется дозировка инъекционной смеси для взрослых?

Рассчитать необходимую дозу для тех, кто старше 12, просто. Литическая смесь от температуры взрослым прописывается только в случаях очень высоких температур. Состав ее остается таким же, как и для детей, однако изменяются пропорции. Взрослому человеку вполне будет достаточно 1 мл анальгина, 1 мл димедрола и 1,5 мл папаверина или но-шпы. Все это вводится внутримышечно и начинает действовать уже в течение четверти часа.

Как делается укол?

Изначально ампулы с препаратами нужно нагреть до температуры тела, особенно если укол делается ребенку. Можно дать подержать их в ладошках на некоторое время. Игла и ампулы должны быть продезинфецированы. Литическая смесь от температуры смешивается в одноразовом шприце. Затем спиртом обрабатывается место укола. Игла вводится на 2/3 своей длины перпендикулярно коже. Инъекция делается в верхний наружный квадрат ягодицы. Лекарство вводится медленно, благодаря чему оно успевает рассасываться в тканях.

Какая рекомендуется дозировка литической смеси в таблетках?

Литическая смесь в таблетках в определенных случаях бывает более уместной, чем обычные уколы. Широко употребляется литическая смесь от температуры для детей, дозировка в таблетках которой включает следующие порции препаратов: по ¼ таблеток анальгина, супрастина и но-шпы. Таблетки можно потолочь и разбавить водой, а затем дать выпить ребенку. Вместо таблеток можно использовать жидкость из ампул этих препаратов.

Также подходит литическая смесь от температуры в таблетках взрослому. Пропорции этого способа введения лекарства простые: 1 таблетка анальгина, 1 – супрастина или димедрола и 1 – но-шпы или папаверина.

Таблетки нужно запивать водой в достаточном количестве.

Какие существуют противопоказания к применению литической смеси?

Литическую смесь не следует применять в следующих случаях:

Боль в животе, сопровождающаяся высокой температурой. Если у ребенка или взрослого присутствуют данные симптомы, следует дождаться врача. Их причиной может быть аппендицит, а литическая смесь купирует эти проявления болезни. Вовремя недиагностированный аппендицит может спровоцировать серьезные негативные последствия, в числе которых и летальный исход.

Индивидуальная непереносимость компонентов. Когда тест на аллергию, упомянутый ранее, показал раздражение, от этого метода лечения следует отказаться.

Возраст до 6 месяцев. Температуру малышу следует сбивать другими способами, а если врачом все же была назначена литическая смесь от температуры, дозировка должна соответствовать рекомендациям доктора.

Прием анальгиносодержащих препаратов менее чем за четыре часа до инъекции. Большое количество принятого анальгина или других средств, входящих в состав смеси, повлечет за собой передозировку и побочные эффекты.

Какие существуют побочные эффекты у литической смеси?

Бесконтрольное лечение этим препаратом может быть губительным как для детского, так и для взрослого организма. Всегда нужно неукоснительно следовать инструкциям врача и не использовать смесь слишком часто. Организм человека, который постоянно борется с гипертермией этим способом, может стать невосприимчивым к другим лекарствам. Довольно часто препарат переносится легко, но возможны сонливость и рассеянность внимания.

Как сбить температуру другими способами?

Прежде чем пользоваться такими сильными средствами, как литическая смесь, обязательно нужно попробовать сбить температуру более щадящими методами, которые не навредят и активизируют организм на борьбу с болезнью.

В первую очередь сюда относится обильное питье. Обезвоживание – вечный спутник высокой температуры. Чтобы восполнить электролитный баланс, следует выпивать больше воды, чем обычно. Лучше отказаться от сладких напитков и пить простую воду.

Важно, чтобы комната, в которой находится больной, оставалась прохладной. Множество теплых одеял и душное помещение может спровоцировать тепловой удар, а это только усугубит ситуацию и ухудшит самочувствие больного.

Можно использовать методы народной медицины: обертывания и обтирания. Обтереть больного следует раствором из уксуса и теплой воды смешанного 1:5. Обтирается все тело, начиная со спины и живота и заканчивая руками и ногами. Можно использовать компрессы из отвара мяты или тысячелистника. Их прикладывают ко лбу, вискам и запястьям.

Если после этих процедур никакого улучшения не последовало, нужно прибегнуть к лекарствам из домашней аптечки. Если же и они не помогли, тогда следует использовать литическую смесь. В случаях, когда после литической смеси температура не упала, нужно срочно вызывать врача или скорую. Высокая температура, которая долго не снижается, может вызвать судороги, спазмы и даже остановку дыхания.

Как правильно применять литическую смесь для детей разного возраста

Заболевание малыша, сопровождаемое сильным жаром, – тяжёлое испытание для всей семьи. Не всегда популярные лекарства для детей справляются с высокой температурой, а большинство сильнодействующих препаратов небезопасны для детского здоровья. Если столбик термометра продолжает показывать неутешительные цифры, крохе может помочь литическая смесь.

Что такое литическая смесь

Это своеобразный коктейль из лекарственных препаратов, который применяется для экстренного снижения высокой или плохо сбивающейся температуры у малышей и взрослых. Используют средство и в качестве обезболивающего.

Литическую смесь обычно применяют фельдшеры скорой помощи, однако, если с вызовом неотложки могут возникнуть проблемы, то стоит заранее проконсультироваться у педиатра и после его инструктажа (сколько каждого компонента нужно брать для изготовления смеси в вашем конкретном случае) и разрешения делать этот препарат самостоятельно в домашних условиях.

Наличие высокоактивных веществ предполагает тщательное соблюдение дозировки и осторожность при использовании.

Состав и действие компонентов

Литическая смесь состоит из трёх основных компонентов: анальгина, димедрола и папаверина. Главное действующее вещество – 50-процентный раствор анальгина. Его задача – избавить ребёнка от жара и снизить температуру. Важное дополнение – 1-процентный раствор димедрола, обладающий антигистаминным эффектом и усиливающий работу анальгетика. 2-процентный раствор папаверина снимает спазмы мышц, расширяет периферические сосуды, увеличивает отдачу тепла.

Врач может заменить компоненты препарата, если у ребёнка выявлена их индивидуальная непереносимость. Так, вместо димедрола применяют супрастин или тавегил. Вместо же папаверина иногда добавляют но-шпу.

Кстати, литическая смесь для малышей появилась ещё до изобретения анальгина. В неё входили 10-процентный амидопирин, 2-процентный кодеин, 1-процентный димедрол и 2-процентный папаверин. После лабораторных исследований амидопирин заменили анальгином, а кодеин и вовсе исключили из списка компонентов.

Фотогалерея: компоненты литической смеси

Показания к применению

У малышей температура поднимается очень быстро, за короткое время достигая критической отметки. Главная причина её повышения – простудные заболевания. Иногда жар появляется при прорезывании зубов, после плановых прививок. Врачи советуют применять литическую смесь, если:

• у заболевшего ребёнка бледная кожа, холодные конечности, учащённое сердцебиение, озноб. Это состояние, называемое белой лихорадкой, требует неотложной помощи. Поэтому в этом случае лучше сбить жар, не дожидаясь, пока температура превысит показатель в 38,5 °C;
• привычные жаропонижающие средства в виде сиропов, таблеток и свеч не дали заметного эффекта;
• малыш не может пить сироп или глотать горькие таблетки, у него рвота или обморочное состояние;
• ребёнок плохо переносит высокую температуру, при жаре у него начинаются фебрильные судороги.

Мнение педиатров однозначно: сбивать жар у малыша следует, если температура превышает 38,5 °C (единственное исключение – белая лихорадка). Более низкие показатели не считаются опасными для детского здоровья и свидетельствуют о том, что организм пытается бороться с инфекцией.

Как правильно применять литическую смесь

Перед тем как дать жаропонижающий препарат малышу, нужно правильно и точно рассчитать необходимые дозы в зависимости от возраста ребёнка. Не пытайтесь назначить дозировку самостоятельно, обратитесь за помощью к врачу!

Таблица: особенности применения литической смеси

Укол

Конечно, лучше доверить инъекцию медицинскому работнику, но если ситуация критическая и вы обладаете необходимым опытом, можете сделать укол самостоятельно. Как правило, литическую смесь вводят внутримышечно. Такой способ позволяет быстро снизить высокую температуру и избавить ребёнка от жара. Для лучшего всасывания компонентов смеси в кровь, нужно соблюдать ряд несложных правил:

• перед употреблением недолго подержите ампулы в ладонях, чтобы подогреть их до температуры тела;
• место укола протрите спиртом;
• наберите в одноразовый шприц все препараты в назначенных врачом дозах, встряхните шприц несколько раз, выпустите воздух из шприца;
• введите иглу в ягодицу на 2/3, затем медленно нажимайте на поршень, чтобы лекарство равномерно распространялось по тканям;
• место укола обработайте спиртом.

Внутримышечное введение литической смеси обычно снижает температуру уже через 15 минут

Оральный приём литической смеси в жидком виде или в таблетках

Если сделать укол ребёнку не удаётся, врачи разрешают вместо внутримышечного способа введения просто выпить препарат. Однако подействует он медленнее, чем инъекция: температура снизится через 30 минут.

Приём анальгина орально не рекомендован детям младше восьми лет из-за негативного воздействия на слизистую оболочку желудка и кишечника.

Ещё один вариант – изготовление смеси из таблеток. Возьмите необходимую часть (схему дозирования стоит рассчитать заблаговременно вместе с вашим педиатром) от каждой из таблеток анальгина, димедрола и папаверина, растолките их в мелкий порошок, перемешайте и дайте выпить малышу. Главное преимущество таблеточной формы – в случае передозировки желудок малыша можно будет промыть.

Противопоказания и побочные эффекты

Несмотря на высокую эффективность литической смеси, у неё выявлен ряд противопоказаний. Откажитесь от использования этого сильнодействующего препарата, если:

• высокая температура у малыша сопровождается болью в животе. Жар и болевые ощущения – возможные симптомы аппендицита, а анальгин притупляет боль и затрудняет постановку точного диагноза;
• в предыдущие шесть часов вы уже сбивали температуру препаратами, входящими в состав «тройчатки»;
• маленькому пациенту не исполнилось 12 месяцев;
• у ребёнка или у одного из родителей есть аллергия хотя бы на один из компонентов смеси.

Несоблюдение врачебных инструкций и слишком часто применение этого средства приводит к невосприимчивости детского организма к другим лекарствам. Обычно однократное использование литической смеси дети переносят легко, но в некоторых случаях возможны побочные эффекты: сонливость и рассеянное внимание.

Видео: доктор Комаровский о возможных последствиях применения анальгина и димедрола у детей

Что делать при передозировке

К сожалению, передозировка компонентами литической смеси возможна. И происходит она по невнимательности родителей. Мамы и папы самостоятельно пытаются определить пропорции частей смеси и совершают ошибки или дают лекарственное средство слишком часто, в результате чего доза препарата или одного из его компонентов превышает допустимую в несколько раз.

При передозировке анальгином у малыша:

• появляется тошнота;
• резко снижается температура;
• учащается дыхание.

При передозировке димедролом:

• краснеет лицо;
• дыхание затрудняется или, напротив, учащается;
• появляется сухость во рту;
• в особо тяжёлых случаях начинаются судороги.

При передозировке папаверином у ребёнка:

• возникает сонливость, слабость;
• понижается давление.

Если у малыша после приёма литической смеси наблюдаются подобные симптомы, незамедлительно звоните в скорую помощь. До её приезда дайте малышу сорбент, например, Энтеросгель, Полисорб или активированный уголь. Если этого сделать не удалось, в крайнем случае можно вызвать рвоту: ребёнка необходимо обильно напоить прохладной водой, а потом надавить двумя пальцами на корень языка.

Следите за температурой тела: если она резко снизилась, укройте ребёнка одеялом. Не следует давать другие лекарственные средства, чтобы избежать нагрузки на печень.

Отзывы родителей

Моему ребёнку в 11 месяцев (у нас зубки резались), когда не помогал Нурофен и начались фебрильные судороги, делали литичку <…>, температура с 40 спала до 37,5 за 5–10 минут. Но это только при условии, что температура выше 38,5 и не помогают другие жаропонижающие.

Елена
http://www.03.ru/section/parents/2485922

Мы используем литическую смесь, когда температура поднимается выше 39,3. <…> Это если ничего больше не помогает. <…> Температуру до 38 не снижаем в принципе.

Тамара
http://www.03.ru/section/parents/2485922

Нам в скорой немного другой состав литической смеси сказали: парацетамол (например, Панадол) + Супрастин + Но-шпа. И обязательно согреть ножки, иначе температура не снизится, можно надеть шерстяные носки. И укрыть только тонкой простынкой. На лоб, примерно на линию роста волос, можно мокрый платочек приложить. <…> И ещё смотреть на состояние ребёнка: угнетённое сознание, «мраморная» кожа, холодные ручки и ножки – серьёзные симптомы, надо вызывать скорую.

aZiza
http://forum.samarskie-roditeli.ru/topic/22121-zharoponizhajushie-sredstva/page-3

Я, например, при высокой температуре делаю своему литичку <…> сразу снимает температуру. Так что можно в уколе сделать но-шпу, но пить её из ампулы не советую, она очень горькая на вкус. Мало того, после неё немеет всё во рту, такое ощущение вязкости, что не стоит даже и пробовать.

redkay
http://forum.materinstvo.ru/lofiversion/index.php/t1697820–100.html

Видео: как можно и как нельзя сбивать температуру у детей

Врачи оправдывают применение литической смеси для детей лишь при опасных показателях термометра и невозможности снизить температуру другими лекарствами. Однако ситуации бывают разными, поэтому рекомендуется хранить в семейной аптечке ампулы анальгина, димедрола и папаверина.

Специальный психолог, автор статей на самые разные темы, касающиеся воспитания, развития и здоровья детей. Оцените статью: Поделитесь с друзьями!

Литическая смесь для детей — состав и дозировка

Высокая температура у ребенка всегда становится поводом для беспокойства родителей. Они могут облегчить его состояние, приготовив в домашних условиях особое жаропонижающее средство – литическую смесь.

Для его безопасного использования родители должны владеть определенной информацией о дозировке, способах введения и противопоказаниях лекарства.

Применение

Литическая смесь – средство, которое применяется для снижения температуры в экстренных ситуациях. Применять ее можно только убедившись, что обычные лекарства (сиропы, свечи) не помогают, а состояние ребенка тяжелое. [note]Сильный жар, сопровождающийся лихорадкой, часто наблюдается при гриппе.[/note]Педиатры не рекомендуют сбивать температуру, если ее значение не превышает 38,5 ˚С. Такая температура тела не представляет опасности и свидетельствует о том, что организм борется с инфекционным заболеванием. Существуют исключения, когда применение жаропонижающих средств показано при достижении порога в 37,5 ˚С:

• Озноб, бледность кожи, боль в мышцах и суставах;
• Общее ухудшение состояния;
• Ранее возникали судороги из-за сильного жара.

По способу введения различается литическая смесь для детей в таблетках и в уколах. Второй вариант более эффективен, потому что температура начинает снижаться уже через 15 минут после инъекции. Средство нельзя использовать чаще 1 раза в 6 часов, общий период снятия жара таким способом не должен превышать 1 суток.

Состав

В состав литической смеси входят 3 компонента: 50% анальгин, 1% димедрол, 0,1% папаверин. Этот тандем снимает жар и боль, предотвращает возникновение аллергии. [important]При отсутствии в домашней аптечке раствора димедрола он может быть заменен тавегилом или супрастином.[/important]Дозировка литической смеси для детей рассчитывается на основании их возраста: на каждый год жизни необходимо по 0,1 мл каждого из 3-х препаратов. Для двухлетнего ребенка объем смеси будет состоять из 0,2 мл анальгина, 0,2 мл димедрола и 0,2 мл папаверина. Полученный раствор вводится в ягодицу.

Если отсутствует возможность сделать инъекцию, можно изготовить смесь из таблеток. Для этого берется по четвертинке анальгина, супрастина и парацетамола, измельчается и дается ребенку.

Противопоказания

Для применения литической смеси есть определенные ограничения. Ее нельзя использовать:

• До достижения ребенком возраста 6 месяцев;
• Если температура сопровождается болями в животе;
• При непереносимости компонентов смеси;
• Если в течение последних 4-х часов уже предпринимались попытки снижения температуры при помощи одного из препаратов, которые включаются в состав смеси.

[tip]Узнайте на нашем сайте, стоит ли давать ребенку антибиотики в таблетках.

Практический совет мамам: можно ли грудничку давать глицин.

Не спешите давать детям Супрастин, прочтите здесь, какой должна быть безопасная дозировка.[/tip]

Перед использованием смеси необходимо провести тест на аллергию, капнув раствор на нижнее веко. Если по истечению получаса не разовьется негативных реакций (покраснения, зуда, боли), то препарат можно применять.

Заключение

Литическая смесь – сильнодействующее средство экстренной помощи, поэтому нельзя применять ее при любом повышении температуры. Ее бесконтрольное использование может снизить восприимчивость организма к жаропонижающим препаратам, спровоцировать ослабление иммунитета и частые простудные заболевания.

Применение литической смеси оправданно в крайних случаях, когда другие жаропонижающие средства не дают результата.

Похожие статьи

что можно, а что категорически запрещено — Рамблер/новости

Детские болезни — вещь непредсказуемая. Абсолютно здоровый ребенок, который минуту назад прыгал и сносил стены, внезапно оказывается горячим, как уголек. Сбивать температуру или подождать?

Лихорадка, это сигнал для мозга — вырабатывать больше веществ, которые помогут победить инфекционное заболевание. 80 % детских болезней — это ОРВИ. А самый главный соперник вирусов — интерферон, специфический белок, уровень которого напрямую зависит от температуры тела. Другими словами, чем выше температура, тем больше собственного лекарства вырабатывается!

Как снизить температуру

У нас принято сбивать температуру сразу, как только она обнаружилась. Но это не совсем правильно, вернее, совсем неправильно! Лекарства, снижающие температуру, не дают шансов организму победить болезнь в кратчайшие сроки.

Запомни золотое правило:

Давай рассмотрим, как снизить температуру у ребенка максимально эффективно, не навредив при этом.

Когда сбивать?

Некоторые дети при 39° чувствуют себя отлично, а другие при 37,5° встать с постели не могут. Выбор в пользу лекарств очевиден. У каждого ребенка своя грань, но рисковать в ее поисках не стоит. Если температура поднялась до 39,5° — действуй незамедлительно!.

Особого контроля требуют дети с судорожным синдромом. Если ранее были замечены фебрильные судороги на фоне высокой температуры, рекомендовано применение лекарственных препаратов при повышении до 38,5° или того уровня, который укажет ваш педиатр. Это касается и возраста до 3 месяцев.

В этой статье мы говорим о температуре, измеренной в подмышечной впадине. Измерять ее нужно не менее 10 минут обычным термометром. Ректальная всегда выше на 1 градус, для достоверного результата достаточно 5 минут.

Главное, что ты должен сделать при повышении температуры тела, — создать условия для ребенка, в которых он сможет максимально терять тепло. А это возможно только двумя путями: через пот или при согревании вдыхаемого воздуха.Попытайся создать в комнате прохладную температуру (17–20 °С), при этом одень ребенка в дополнительную кофточку или укрой одеялом. Обеспечь питьевой режим (50–100 мл на 1 кг веса ребенка). Без соблюдения этих правил, выздоровление наступит значительно позже, а риск развития осложнений увеличивается.

Твоя задача не паниковать, а использовать комплексный подход: лекарственные препараты, параметры воздуха, обильное питье. Причем последние два пункта обладают не меньшей эффективностью, чем любой сироп или таблетка!Согласно рекомендации ВОЗ, препаратами первого выбора для детей являются «Парацетамол» и «Ибупрофен». В домашней аптечке должны быть оба, желательно в разных формах. Для детей до 6 лет это сироп или ректальные свечи.

Сироп оказывает действие через 15–20 минут после употребления, но в его составе много химических добавок, ароматизаторов, красителей. Свечи через 40–50 минут, но жаропонижающий эффект держится дольше. Они незаменимы, когда у ребенка тошнота или рвота, использовать их нужно после дефекации, если это возможно.

В аптеке «Парацетамол» продается под видом таких препаратов: «Панадол», «Калпол», «Эффералган», «Дофалган», «Мексален», «Доломол», «Цефекон». «Ибупрофен» менее безопасен, но более эффективен. Его аналоги: «Ибуфен», «Нурофен», «Бофен», «Маркофен», «Детский Мотрин», «Ибунорм Беби», «Бруфен».

Очень часто производители указывают возраст на этикетках препарата. Но не все дети одинаковы, нужно рассчитывать дозировку согласно весу ребенка. Смотри правила расчета на картинке.

Будь очень внимательна, самая частая ошибка — когда путаются миллиграммы (мг) и миллилитры (мл). Рассмотрим пример. На этикетке написано: «100 мг действующего вещества в 5 мл суспензии». Это значит, что ребенку весом 10 кг, которому нужно 150 мг «Парацетамола», понадобится 7,5 мл лекарства. Если это «Ибупрофен», то 5 мл. Это именно тот случай, когда пригодится школьная математика.

Нужную дозировку жаропонижающих свечей спрашивай в аптеке. Лучше использовать их на ночь, из-за длительного эффекта. Разовая доза «Парацетамола» в свечах составляет до 20 мг/кг, учитывай ее при подсчете суточной.

Если температура поднимается раньше минимального срока до следующего приема, указанного в инструкции, чередуй между собой лекарственные препараты. Это должны быть не разные названия лекарств, а разные действующие вещества («Парацетамол» или «Ибупрофен»). Под непохожими этикетками часто спрятан один и тот же препарат.

Если после приема лекарства температура упала на 1–1,5°, это очень хорошо! Не стоит добиваться 36,6° — это огромный стресс для организма и сосудов.

Запрещенные препараты

Категорически не рекомендуется давать детям «Аспирин» (ацетилсалициловая кислота), «Анальгин» (метамизол натрия), «Нимесулид». У них выше риск развития и больше тяжесть побочных реакций.Популярная в нашей стране «литическая смесь» на основе Анальгина может применяться однократно, когда другие, более безопасные препараты недоступны. Постоянный прием абсолютно недопустим как для детей, так и для взрослых.

«Аспирин» в сочетании с вирусной инфекцией может вызвать тяжелейшее поражение печени и головного мозга — синдром Рея, при котором смертность достигает 20 %. «Нимесулид» также запрещен из-за риска развития токсического гепатита. Это касается детского возраста до 12 лет.

Белая лихорадка

Обычно ребенок с высокой температурой горячий на ощупь, с розовым или красноватым оттенком кожных покровов. В таком случае можешь сохранять спокойствие — терморегуляция и теплоотдача работают прекрасно. Но если высокая температура сопровождается бледностью кожи, ознобом, холодными конечностями — возникает спазм сосудов.

Причин может быть несколько: от поражения нервной системы и нехватки жидкости, до снижение давления. В таком случае растирай холодные руки и ноги, пока они не порозовеют, дай ребенку половинку спазмолитического препарата («Дротаверин», «Нош-па»). Исключи абсолютно все холодные компрессы и обертывания. Помни, жаропонижающее не будет действовать полностью, пока присутствует спазм. Если не удается снизить высокую температуру в течение 2–3 часов, незамедлительно вызывай скорую помощь!

Отвлекающие процедуры

Забудь о спиртовых и уксусных растираниях! Чувствительная детская кожа мгновенно всасывает опасные вещества и возникает риск отравления.Нельзя использовать в домашних условиях грелки со льдом, влажные холодные простыни, холодные клизмы. Внешне кажется, что температура уменьшилась, но такой результат возник вследствие спазма сосудов кожи! При этом замедляется движение крови, уменьшается потоотделение и теплоотдача. Как результат — температура внутренних органов увеличивается. Это очень опасно!

Максимально, что ты можешь сделать, — это холодная повязка на лоб ребенка, чтобы облегчить состояние, но только после применения жаропонижающего.

Горчичники, горячие ванны для ног и паровые ингаляции несут больше вреда, чем пользы. При малейшем подозрении на температуру, применение этих процедур спровоцирует ее повышение. Если хочется успокоить себя и провести эксперимент над собственным ребенком — пожалуйста, на свой страх и риск, но только когда у него нормальная температура!

Иногда успокоительные для родственников помогают лучше самых качественных горчичников.

В большинстве случаев дети выздоравливают самостоятельно, без значительного лекарственного вмешательства. Иногда допустимо применение народных средств в облегчении общего состояния. Наряду с обильным питьем предложи малышу теплые и полезные молочные напитки. Они помогают при кашле, ларингите и очень вкусные. Это может быть молоко с мёдом, какао-маслом, прополисом. Но только при отсутствии аллергии на эти продукты!Добавь в теплое молоко чайную ложечку мёда, перемешай. Пить такой напиток лучше на ночь, он хорошо успокаивает. Какао-масло отлично справляется с болью в горле, если его растворить в теплом молоке.

Можешь купить в аптеке 10%-ную настойку прополиса, она стоит недорого. Добавь 10 капель в теплое молоко, неважно, полстакана это или одна ложка. Такое средство хорошо справляется с легочными заболеваниями, улучшает самочувствие. Принимать нужно непосредственно перед сном. Проверено на собственном опыте — работает! Прополис — это кладезь целебных веществ, он благоприятно влияет на все системы человеческого организма.

В лечении детских болезней руководствуйся только здравым смыслом и не паникуй. Если сомневаешься в своих действиях — обязательно проконсультируйся с педиатром. Обратись к нему, если симптомы болезни продолжаются более 5 дней.

Читайте НАС ВКонтакте

когда нужно сбивать температуру, народные средства, аптечные средства

Практически все воспалительные заболевания (а также инфекции) у домашних питомцев сопровождаются повышением общей температуры тела. Это совершенно нормально, организм в это время борется с инфекцией. Но владельцам нужно знать, как сбить температуру у собаки в домашних условиях: иногда она повышается до опасных пределов.

Когда нужно сбивать температуру

Но сперва необходимо рассказать, когда действительно нужно сбивать температуру:

• При резком ее повышении свыше 2°С от верхней границы нормы. У собак нормальная температура тела варьируется в пределах от 37,5° до 39°С.

• В случаях, когда животное лежит «пластом» и на что не реагирует, отказываясь от еды и даже от воды. Если температуру не сбить, собака может погибнуть.

• Кроме того, рекомендуется сбивать температуру в ситуациях, когда у питомца развилась выраженная лихорадка перемежающего типа (температурные «качели»). Столь резкие перепады крайне тяжело отражаются на организме собаки и в некоторых случаях могут приводить к летальному исходу.

Признаки повышения температуры у собаки

У собак повышение температуры чаще всего сопровождается следующими признаками:

• Животное становится вялым, апатичным, стремится больше лежать в отдаленных углах дома.

• При сильном повышении температуры у собаки полностью пропадает аппетит.

• Многие инфекционные заболевания сопровождаются также рвотой или/и поносом.

• Обычно повышение температуры также сопровождается ознобом.

• Все видимые слизистые оболочки обычно бледнеют.

Но! Точно говорить о повышении температуры можно только после ее измерения. Дело в том, что все вышеописанные признаки характерны не только для повышения, но и для понижения общей температуры тела. В частности, такое бывает при сепсисе и тяжелых интоксикациях. Отметим также, что охлаждение организма зачастую куда опаснее, нередко это происходит незадолго до смерти больного животного.

Методики снижения температуры «подручными средствами»

Далеко не всегда есть реальная необходимость использования мощных медикаментов. Кроме того, далеко не во всех случаях у владельца есть ветеринарные препараты. Пользоваться же медицинскими жаропонижающими средствами мы категорически не рекомендуем, так как многие из них ядовиты для животных! А потому всегда нужно помнить о методах народной медицины:

• Перво-наперво нужно поместить животное в прохладное, затемненное и хорошо проветриваемое помещение. В случаях несильной лихорадки может хватить только этого.

• Питомцу дают как можно больше питья в виде чистой и прохладной воды.

• Следует обеспечить заболевшему животному полный покой, оградить его от громких звуков и прочих стрессовых факторов.

Но все вышеописанное – лишь «механические» способы сбивания температуры, которые помогают лишь в легких случаях. При тяжелой лихорадке необходимо что-то более существенное:

• Сперва желательно смочить шерсть питомца прохладной водой. При этом очень важно, чтобы в помещении не было сквозняков! В противном случае собаке станет еще хуже. Если пес крупный, полностью смачивать его шерсть не стоит. Лучше смочить прохладной водой куски ткани и прикладывать их к животу, внутренней части бедер и спине. По мере необходимости ткань снова смачивают и накладывают на тело питомца.

• Если животное сильно мохнатое, лишнюю шерсть на смачиваемых участках желательно состричь. Это улучшит и ускорит процесс теплообмена.

• Чтобы успокоить животное и, хотя бы отчасти, справиться с болью, питомцу дают таблетку димедрола. Конечно, димедрол – не полноценный анальгетик, зато он вполне безопасен и не навредит больной собаке.

• Если все вышеописанное не помогает, и температура держится на одном уровне, или же есть тенденция к ее увеличению, в ход пускают литическую смесь. Для ее приготовления берут анальгин, Но-Шпу и димедрол в соотношении 1:1:1. Доза – по 0,1 мл на каждый килограмм веса. Препарат вводится только в виде инъекций, внутримышечно!

• Кроме того, в крайних случаях допускается использование 1% раствора кетофена. Доза – по 0,2 мл на каждый килограмм живого веса. Допустимо как внутримышечное, так и подкожное введение.

Об этом нужно помнить

Несмотря на то, что мы привели несколько примеров медикаментозного снижения критически высокой температуры у собак, постоянно пользоваться ими нельзя. Лекарства самостоятельно можно водить, только если по каким-то причинам нет возможности сразу вызвать ветеринара!

Долго сбивать температуру мы настоятельно не рекомендуем: скорее всего, у животного есть какая-то инфекция, и в этом случае необходимо сразу определять ее вид и начинать лечение. Длительная подача жаропонижающих препаратов смазывает клиническую картину и осложняет проведение терапии!

Касается каждого

Почему медики скорой помощи больше не ставят литическую смесь?
В стационар попадают  дети с высокой температурой, которую медики не могут сбить из-за отсутствия в аптечке скорой нужных препаратов
Батайские медики оказались бессильны против высокой температуры  – выше 40 градусов у детей. Единственное, что они могут предложить – это поездку в больницу. Почему-то только там ребенку могу сделать спасительный укол.
Температура

Кира Самусевич мама Саши, 4 года:

 — Первые симптомы болезни появились к вечеру субботы. Сын начал кашлять, нос «потек», но на боли в горле не жаловался. Педиатра вызывать не было смысла – выходной день. Дала обычные в таких случаях лекарства. Утро воскресенья. Термометр показал 39,7. «Нурофен», который я дала сыну, вскоре оказался на паласе. Пришлось вызвать скорую.

Медики  прибыли быстро. Осмотрели сына. Хрипов в груди не обнаружили. Да, горло красное, да, несильный насморк, но не более. Но в самом главном он оказался не в силах помочь. Оказалось, что срочно сбить Саше температуру невозможно. По словам доктора, в его аптечке нет анальгина, одного из компонентов литической смеси. Потому, что нынче анальгин запретили использовать специалистам скорой помощи. Врач предложил госпитализацию, но я отказалась. Решила попробовать жаропонижающие свечи, обтирания и все-таки дотянуть до понедельника.

Свечи помогли, но ненадолго. Ближе к ночи я снова набирала 03. Температура перевалила за 40. Собрала впопыхах пакеты, потому что понимала: визита в больницу не избежать. Мне опять задали вопрос о госпитализации, на этот раз согласилась. Боялась, что температура поднимется снова. А в больнице литическую смесь ставят.

Врачи в приемном спрашивали у фельдшера: «Литическую ставили? Как нет? Почему?! Что, правда, нельзя?!» Пожимали плечами, удивлялись.

При поступлении Саша сразу получил укол антибиотика.
Дома тоже можно

В 7 утра снова укол, анализы, визит к лор-врачу. Температура у Саши поднялась один раз, утром — около 38 градусов. Снова  укол  литической.    Врач сообщил — ОРВИ. Температура больше не появлялась.

Ближе к вечеру подошла к врачу и спросила, нам принципиально лечиться в стационаре или можно дома. Мне ответили, решайте сама. Порекомендовали сдать в Ростове анализ на герпесно-вирусную инфекцию, так как увеличены лимфоузлы. Я написала отказ от лечения. Вечером понедельника уехала с сыном домой.

Участковый педиатр пришла во вторник, подтвердила диагноз ОРВИ. Выписала те же лекарства, что и в больнице, только уколы антибиотика заменила на суспензию. Мы исправно лечились. Через неделю нам закрыли больничный.
Осадок

Может, кто-то меня осудит за то, что ушла с ребенком из больницы. Но оставаться желания не было никакого. Лечение, по сути, сводилось к трем уколам антибиотика в день. Остальное я могла прекрасно дать дома. Найти медсестру, готовую подработать на уколах. Кормить ребенка домашней едой. Укладывать спать в собственную постель.

Осадок остался. Получается, чтобы сбить высокую температуру, приходится ехать в больницу? А если человеку трудно передвигаться? Если до больницы он не доедет? У каждого ведь свой «запас прочности».

В подобной ситуации оказалась и моя коллега из рекламного отдела неделей раньше. У мальчика оказалось банальное ОРВИ, которое чаще всего лечат в домашних условиях с помощью участковых педиатров.  В больнице я познакомилась с соседкой по палате  Ириной. У ее сына было серьезное воспаление уха, поэтому она пролежала в отделении гораздо дольше, чем я. После списались с ней в «Одноклассниках». Ира сказала, что за 10 дней пребывания в больнице у нее сменилось еще три соседки по палате после меня. Женщины тоже сбивали детям температуру, а затем писали отказ от лечения.

Продолжение статьи читайте в газете Вперед от 6 апреля

Аптечка при коронавирусе: Вирусолог перечислил самое необходимое

Вирусолог Александр Чепурнов перечислил самое необходимое, подсказав, из каких именно лекарств можно составить эффективную аптечку при коронавирусе. Он также оценил рекомендации своего коллеги Сергея Зырянова.

Вирусолог, доктор биологических наук Александр Чепурнов подсказал, что именно необходимо включить в домашнюю аптечку на случай коронавируса у кого-то из членов семьи.

Ранее соответствующие рекомендации представил заведующий кафедрой общей клинической фармакологии РУДН, профессор Сергей Зырянов. Он включил в обязательный набор жаропонижающие препараты, лучше всего парацетамол, назальные капли. Этими советами врач поделился с «АиФ».

Чепурнов в целом согласился с рекомендациями коллеги. Он дополнил их инструкцией по тому, как именно следует принимать парацетамол.

Надо помнить, что правильная температура, когда человек болеет, это 37,5-38,5 °C. Если она держится в таких пределах, сбивать её ничем не надо. Потому что нужные биохимические процессы в организме лучше идут при таких условиях. Если выше, то рекомендуется действительно парацетамол. Он лучше всего себя показал. Не ибупрофен, не литическая смесь. Но есть нюанс: по собственному опыту могу сказать, что через какое-то время парацетамол может уже не влиять активно. А им нельзя злоупотреблять. Мы помним: не больше трёх приёмов в день, иначе могут быть тяжёлые осложнения, — предупредил собеседник Царьграда.

Вирусолог также назвал и ряд других вспомогательных средств. В их числе, в частности, витамины.

Цинк можно сразу же начинать пить. Также витамины Д и С, как правило, очень показаны в этой ситуации. Причём тоже с самого начала инфекции. Это самые основные моменты. И ещё кислород. Хорошо бы и его иметь, он поможет в моменты, когда становится тяжко. В домашних условиях было бы отлично иметь возможность через специальные подушки получать кислород, — добавил Чепурнов.

Нашли ошибку в тексте?
Выделите ее и нажмите CTRL + ENTER

детергентов для лизиса клеток и экстракции белков | Thermo Fisher Scientific

Детергенты — это класс молекул, уникальные свойства которых позволяют манипулировать (нарушать или формировать) гидрофобно-гидрофильными взаимодействиями между молекулами в биологических образцах. В биологических исследованиях детергенты используются для лизиса клеток (высвобождения растворимых белков), солюбилизации мембранных белков и липидов, контроля кристаллизации белков, предотвращения неспецифического связывания в процедурах аффинной очистки и иммуноанализа, а также в качестве добавок при электрофорезе.

Свойства и виды моющих средств

Состав ПАВ. Обобщенная структура отдельной молекулы детергента (вверху) и полная структура CHAPS (внизу), пример цвиттерионного детергента.

Химическое определение моющего средства

Моющие средства представляют собой амфипатические молекулы, что означает, что они содержат как неполярный «хвост», имеющий алифатический или ароматический характер, так и полярную «голову». Ионный характер группы полярных голов лежит в основе широкой классификации моющих средств; они могут быть ионными (заряженными, анионными или катионными), неионными (незаряженными) или цвиттерионными (имеющими как положительно, так и отрицательно заряженные группы, но с нулевым суммарным зарядом).

Подобно компонентам биологических мембран, детергенты обладают гидрофобно-связывающими свойствами в результате их неполярных хвостовых групп. Тем не менее, моющие средства сами по себе растворимы в воде. Следовательно, молекулы детергента позволяют диспергировать (смешивать) нерастворимые в воде гидрофобные соединения в водной среде, включая экстракцию и солюбилизацию мембранных белков.

Детергенты при низкой концентрации в водном растворе образуют монослой на границе раздела воздух – жидкость.При более высоких концентрациях мономеры детергента объединяются в структуры, называемые мицеллами. Мицелла представляет собой термодинамически стабильный коллоидный агрегат мономеров детергента, в котором неполярные концы изолированы внутрь, избегая воздействия воды, а полярные концы ориентированы наружу при контакте с водой.

Идеализированная структура мицеллы детергента.

Как количество мономеров детергента на мицеллу (число агрегации), так и диапазон концентраций детергента, выше которого образуются мицеллы (так называемая критическая концентрация мицелл, CMC), являются свойствами, специфичными для каждого конкретного детергента (см. Таблицу).Критическая температура мицелл (CMT) — это самая низкая температура, при которой мицеллы могут образовываться. CMT соответствует так называемой температуре помутнения, поскольку мицеллы детергента образуют кристаллические суспензии при температурах ниже CMT и снова становятся прозрачными при температурах выше CMT.

На свойства моющего средства влияют такие экспериментальные условия, как концентрация, температура, pH буферного раствора и ионная сила, а также наличие различных добавок. Например, CMC некоторых неионных детергентов уменьшается с повышением температуры, в то время как CMC ионных детергентов уменьшается с добавлением противоиона в результате уменьшения электростатического отталкивания между заряженными головными группами.В других случаях добавки, такие как мочевина, эффективно нарушают структуру воды и вызывают снижение содержания КМЦ моющего средства. Как правило, с увеличением ионной силы происходит резкое увеличение числа агрегаций.

Детергенты могут быть денатурирующими или неденатурирующими по отношению к структуре белка. Денатурирующие детергенты могут быть анионными, такими как додецилсульфат натрия (SDS), или катионными, такими как бромид этилтриметиламмония. Эти детергенты полностью разрушают мембраны и денатурируют белки, нарушая межбелковые взаимодействия.Неденатурирующие детергенты можно разделить на неионные детергенты, такие как Triton X-100, соли желчных кислот, такие как холат, и цвиттерионные детергенты, такие как CHAPS.

Свойства обычных моющих средств.

‡ Agg. # = Число агрегации, которое представляет собой количество молекул на мицеллу.

Очищенные моющие растворы

Хотя моющие средства доступны из нескольких коммерческих источников и обычно используются во многих исследовательских лабораториях, важность чистоты и стабильности моющих средств не получила широкого признания.Моющие средства часто содержат следы примесей, полученных при их производстве. Некоторые из этих примесей, особенно пероксиды, которые содержатся в большинстве неионных моющих средств, нарушают активность белка. Кроме того, некоторые типы моющих средств легко окисляются под воздействием воздуха или ультрафиолетового излучения, что приводит к потере их свойств и активности в качестве солюбилизирующих агентов. Мы предлагаем несколько моющих средств высокой чистоты с низким содержанием пероксидов, которые расфасовываются под азотом в прозрачные стеклянные ампулы. Эти моющие растворы Thermo Scientific Surfact-Amps обеспечивают непревзойденное удобство, качество и постоянство всех видов моющих средств.Набор пробоотборника включает 10 различных очищенных моющих средств (семь в формате Surfact-Amps и три в твердом виде).

Структура клеточной мембраны, солюбилизация белков и детергенты

Строение клеточных мембран

Основным фактором, определяющим поведение и взаимодействие молекул в биологических образцах, является их гидрофильность или гидрофобность. Большинство белков и других молекул с заряженными или полярными функциональными группами растворимы (или смешиваются) в воде, поскольку они участвуют в высокоупорядоченной межмолекулярной структуре воды с водородными связями.Некоторые другие белки (или, по крайней мере, части белков), а также жиры и липиды не имеют полярных или заряженных функциональных групп; следовательно, они исключены из упорядоченного взаимодействия воды с другими полярными молекулами и имеют тенденцию объединяться в структуры, имеющие минимальную площадь контакта с полярным окружением. Эта ассоциация неполярных молекул в водных растворах обычно называется гидрофобным притяжением, хотя более точно ее следует понимать как исключение из гидрофильной среды.

Образование и стабильность биологических мембран в значительной степени являются результатом гидрофобного притяжения фосфолипидов, которые образуют двухслойные листы, имеющие гидрофобные липидные «хвосты», ориентированные в пределах толщины листа, и полярные «головные» группы, ориентированные на внешнюю и внутреннюю водную среду. Мембранные белки полностью покрывают толщину мембраны или встроены с одной стороны мембраны в соответствии с их структурой гидрофобных и гидрофильных боковых цепей аминокислот и других функциональных групп.

Разрушение мембраны, связывание с белками и солюбилизация

Обычно умеренные концентрации мягких (т.е. неионных) детергентов нарушают целостность клеточных мембран, тем самым облегчая лизис клеток и экстракцию растворимого белка, часто в нативной форме. При определенных буферных условиях различные детергенты эффективно проникают между бислоями мембраны в концентрациях, достаточных для образования смешанных мицелл с изолированными фосфолипидами и мембранными белками.

Лизис клеток на основе детергентов. Для процедур экстракции белков можно использовать как денатурирующие, так и неденатурирующие реагенты для лизиса клеток.

Денатурирующие детергенты, такие как SDS, связываются как с мембранными (гидрофобными), так и с немембранными (водорастворимыми, гидрофильными) белками при концентрациях ниже КМЦ (т. Е. В виде мономеров). Реакция идет в равновесии до насыщения. Следовательно, свободная концентрация мономеров определяет концентрацию детергента.Связывание SDS является кооперативным (т.е. связывание одной молекулы SDS увеличивает вероятность связывания другой молекулы SDS с этим белком) и превращает большинство белков в жесткие стержни, длина которых пропорциональна молекулярной массе.

Неденатурирующие детергенты, такие как Triton X-100, имеют жесткие и объемные неполярные головки, которые не проникают в водорастворимые белки; следовательно, они обычно не нарушают нативных взаимодействий и структур водорастворимых белков и не обладают свойствами кооперативного связывания.Основной эффект неденатурирующих детергентов — связываться с гидрофобными частями мембранных белков, тем самым придавая им смешиваемость.

При концентрациях ниже CMC мономеры детергента связываются с водорастворимыми белками. Выше CMC связывание детергента с белками конкурирует с самоассоциацией молекул детергента в мицеллы. Следовательно, при увеличении концентрации детергента сверх КМЦ увеличение количества мономеров детергента, связанных с белком, не происходит.

Детергентные мономеры солюбилизируют мембранные белки, разделяясь на бислой мембраны. С увеличением количества моющих средств мембраны проходят различные стадии солюбилизации. Начальная стадия — лизис или разрыв оболочки. При молярном соотношении детергент: мембранный липид от 0,1: 1 до 1: 1 липидный бислой обычно остается неповрежденным, но происходит избирательная экстракция некоторых мембранных белков. При увеличении соотношения до 2: 1 происходит солюбилизация мембраны, в результате чего образуются смешанные мицеллы.К ним относятся мицеллы фосфолипид-детергент, мицеллы детергент-белок и мицеллы липид-детергент-белок. При соотношении 10: 1 все взаимодействия липид: белок нативной мембраны эффективно заменяются на взаимодействия детергент: белок.

Количество детергента, необходимое для оптимальной экстракции белка, зависит от CMC, числа агрегации, температуры и природы мембраны и детергента. Буфер для солюбилизации должен содержать достаточное количество детергента, чтобы обеспечить более 1 мицеллы на молекулу мембранного белка, чтобы гарантировать, что отдельные молекулы белка изолированы в отдельные мицеллы.

Моющие средства, используемые для лизиса клеток. Основные характеристики денатурирующих и неденатурирующих детергентов, используемых для экстракции белков.

Методы удаления моющих средств

Удаление детергента из солюбилизированных белков

Каким бы необходимым и полезным ни было использование детергента для начального лизиса клеток или экстракции мембранных белков, последующие применения или эксперименты с экстрагированными белками могут потребовать удаления части или всего детергента.Например, хотя многие водорастворимые белки функциональны в форме, растворенной в детергенте, мембранные белки часто модифицируются и инактивируются солюбилизацией детергента в результате нарушения взаимодействия природных липидов. В некоторых таких случаях функция мембранных белков восстанавливается, когда они восстанавливаются в двухслойные мембраны путем замены детергента фосфолипидами или другими мембраноподобными липидными смесями.

Функцию отдельного белка можно изучать изолированно, если его сначала очистить, а затем воссоздать в искусственной мембране (хотя восстановление нативной ориентации в мембране является серьезной проблемой).Даже если восстановление функции белка не является проблемой, может потребоваться уменьшить концентрацию детергента в образце, чтобы сделать его совместимым с анализами белка или гель-электрофорезом.

Удалить моющее средство можно разными способами. Диализ эффективен для удаления детергентов с очень высокими КМЦ и / или небольшими числами агрегации, таких как N-октилглюкозиды. Детергенты с низким содержанием CMC и большим числом агрегации не могут быть подвергнуты диализу, поскольку большинство молекул детергента будут находиться в мицеллах, которые слишком велики, чтобы диффундировать через поры диализной мембраны; только избыток мономера может быть подвергнут диализу.Ионообменная хроматография с использованием подходящих условий для избирательного связывания и элюирования представляющих интерес белков является еще одним эффективным способом удаления детергента. Также можно использовать разделение градиентом плотности сахарозы.

Посмотрите это видео, чтобы узнать больше о диализе протеина

Рекомендуемая литература

1. Walker JM (2009) The Protein Protocols Handbook. Третье издание. Нью-Йорк (Нью-Йорк): Springer-Verlag New York, LLC.

Сульфат магния против литического коктейля при эклампсии

Предпосылки:
Эклампсия, возникновение судорог в сочетании с преэклампсией, является редким, но серьезным осложнением беременности.Ряд различных противосудорожных средств использовался для контроля экламптических припадков и предотвращения дальнейших припадков.

Цели:
Целью этого обзора было оценить эффекты сульфата магния по сравнению с литическим коктейлем (обычно хлорпромазином, прометазином и петидином) при лечении женщин с эклампсией. Сульфат магния сравнивается с диазепамом и фенитоином в других Кокрановских обзорах.

Стратегия поиска:
Мы провели поиск в Регистре испытаний Кокрановской группы по беременности и родам (июль 2010 г.) и в Кокрановском центральном регистре испытаний (Кокрановская библиотека 2010 г., выпуск 2).Критерий выбора:
Рандомизированные испытания, сравнивающие сульфат магния (внутривенное или внутримышечное введение) с литическим коктейлем для женщин с клиническим диагнозом эклампсия.

Сбор и анализ данных:
Два автора обзора (Л. Дулей и Д. Чоу) оценили качество испытаний и извлекли данные.

Основные результаты:
Мы включили в обзор три небольших испытания (всего 397 женщин) среднего качества. Сульфат магния был связан с меньшим количеством случаев материнской смертности (отношение рисков (ОР) 0,14, 95% доверительный интервал (ДИ) 0.От 03 до 0,59; 3 испытания, 397 женщин) и лучше предотвращал дальнейшие судороги (ОР 0,06, 95% ДИ 0,03–0,12; 3 испытания, 397 женщин), чем литический коктейль. Сульфат магния также был связан с меньшим угнетением дыхания (ОР 0,12, 95% ДИ от 0,02 до 0,91; 2 испытания, 198 женщин), меньшей комой (ОР 0,04, 95% ДИ от 0,00 до 0,74; 1 испытание, 108 женщин) и меньшей пневмонией. (ОР 0,20, 95% ДИ от 0,06 до 0,67; 2 испытания, 307 женщин). Не было четкой разницы в ОР для любой смерти ребенка (ОР 0,35, 95% ДИ от 0,05 до 2.38, случайные эффекты; 2 испытания, 177 младенцев).

Выводы авторов:
Сульфат магния вместо литического коктейля для женщин с эклампсией снижает ОР материнской смертности, дальнейших судорог и серьезных материнских заболеваний (угнетение дыхания, кома, пневмония). Сульфат магния — противосудорожное средство выбора для женщин с эклампсией; от употребления литического коктейля следует отказаться.

Биология 383 Вирусология | Quant Lab

КОЛИЧЕСТВО ВИРУСА

Введение : Как вы видели на демонстрации
тарелки, много разных видов бактерий, а также
различные типы бактериофагов можно легко выделить из
Сточные Воды.Другие источники окружающей среды также могут давать
множество вирусов, в зависимости от соответствующей цели
клетки и методы обогащения. Независимо от изоляции
метод, часто важно количественно оценить
концентрация или количество полученного вируса. Это справедливо
легко сделать для литических вирусов. Ситуация более
трудно с нелитическими вирусами.

Метод образования бляшек для бактериофага, использованный в данном
упражнения — это общий метод, который можно применять с
модификации, а также вирусов животных и растений.Для растений
вирусы, образцы наносят на листья вместо агара
тарелки. Для вирусов животных образцы добавляются в ячейку.
культур. Во всех случаях образуются отверстия или бляшки там, где клетки
лизируются из-за активности литического вируса. Каждая табличка
представляет собой одну вирусную частицу, способную к инфекционному циклу
которое происходит сначала в одной ячейке, затем повторяется в соседних
клетки. Титр определяется путем подсчета количества
бляшкообразующие агрегаты.Во-первых, количество бляшек на
тарелки подсчитываются. Затем это число умножается на
величина, обратная количеству пробы, добавленной в планшет, и
умноженный на обратную величину коэффициента разбавления. Для
Например, 85 бляшек на пластине, в которую был помещен образец объемом 0,1 мл.
из трубки для разбавления 10 ^-4 равно

85 x 10 x 104 = 8,5 x 10 ⁶
БОЕ / мл.

Для бактериофага иногда используется второй метод.
называется пробой очистки бульона.Серия разведений фага
в бульон, затем инокулируют целевыми бактериями. An
конечная точка определяется на основе самого высокого разведения
производят лизис бактерий и очищают бульонную культуру.
Этот метод можно использовать параллельно с бляшкообразованием.
анализ на данный фаг, а затем использовать его отдельно в качестве быстрого
проверка концентрации образцов.

Основные методы: обоснование

1.Стерильная методика имеет решающее значение при этом типе
Работа. Вы должны предотвратить заражение бактериями и грибками.
от попадания в ваши образцы и планшеты. Все материалы
изначально стерилизованы, в том числе пробирки с разбавителем,
твердые и жидкие среды и наконечники для пипеток. Во время работы
с этими материалами необходимо соблюдать осторожность, чтобы избежать
загрязнение. Трубки и тарелки должны быть закрыты, кроме
на короткое время, чтобы манипулировать ими.Наконечники для пипеток
асептически установлен на дозаторах, и
не прикасаться кончиком дозатора к чему-либо, кроме
желаемый образец.

2. Правильное использование микропипеток важно для получения
соответствующие количества последовательно. Практика проведения
дозатора и нажимая на поршень, пока вы не
комфортный. Плунжер можно установить в два положения.
Первая позиция — составить мерный образец.В
вторая, самая дальняя позиция — выдача содержимого.
Обязательно аккуратно установите наконечник на дозатор.
В противном случае у вас могут быть утечки и несогласованные объемы, поскольку
результат.

3. При этом важно сначала маркировать чашки Петри.
упражнение. Таблички маркируются снизу, а не сверху.
Включите номерной знак, инициалы и дату.

4.Биологические отходы наконечников для пипеток будут
предоставлены мензурки. Использованные пробирки с агаром и пробирки для разведения
размещены в предоставленных стойках. Если есть разлив, позвольте мне
знать. Пятна нужно окружить отбеливателем, затем
покрытые бумажными полотенцами. Загрязненные полотенца нужны
выбрасывать вместе с биологически опасными отходами.

5. Организация при создании и выполнении этого
упражнения необходимы для получения хороших результатов.Прочтите
все упражнение. Помогает работа в паре. Решите, кто это делает
что, особенно при переносе бактерий и разбавленных
фаг в верхние пробирки с агаром. Разумная скорость
необходимо во избежание перегрева образцов. Время тоже
эссенции при заливке верхнего агара в петри
пластина для создания гладкого и ровного слоя.

УПРАЖНЕНИЕ: титрование бактериофага : работа в
пары

Материалы: пара

1 штатив для пробирок Эппендорфа
6 пробирок Эппендорфа с 0.9 мл стерильного физиологического раствора
1 дозатор P-100 установлен на «100» [100 мл
или 0,1 мл]

6 пробирок с расплавленным верхним агаром [3 мл 0,4% TSA каждая]:
на водяной бане
6 тарелок TSA
1 пробирка с указанными бактериями [в лог-фазе
рост]

Материалы: по четыре

1 маркер
1 упаковка стерильных наконечников для пипеток
1 стакан для использованных наконечников для пипеток
1 пробирка с указанным фагом
1 тепловой блок, откалиброванный на 50ºC

Зарегистрированные бактерии:	Фаг, присвоенный записи:
а	а

Процедура:

1 .Промаркируйте пробирки для разведения Эппендорфа и
чашки Петри от «1» до «6», написав на дне
тарелки. На тарелках также этикетка с датой и инициалами
более поздняя идентификация.

2 . Соблюдайте правила асептики и устанавливайте наконечник для дозатора на P-100.
пипетку, как показано, вставив наконечник пипетки в
верхнюю часть одноразового наконечника в коробке и освободив его
коробки, не касаясь кончиком какой-либо поверхности.

3 . Асептически добавьте 100 мл.
[0,1 мл] суспензии фага в пробирку 1, содержащую 0,9
мл физиологического раствора. Выдуйте наконечник в пробирку 1, затем тщательно перемешайте
аспирация пипеткой вверх и вниз три раза. Отказаться
наконечник и установите новый наконечник для дозатора. Передача 100 мл
из пробирки 1 в пробирку 2 и хорошо перемешайте. Передача 100
мл из пробирки 2 в пробирку 3 и перемешайте
хорошо. Замените наконечники дозаторов.

4 . Повторите этапы переноса через трубку 5. Добавьте
ничего к трубке 6 — это ваша контрольная трубка.

Почему меняются наконечники дозаторов между разбавлениями
шаги?

Какое разведение существует в каждой пробирке для разведения,
относительно вашей пробирки?

Трубка 1aaaa	Трубка 2aaaa	Трубка 3aaaa	Трубка 4aaaa	Трубка 5aaaa
а	а	а	а	а

Для чего служит контрольная трубка 6?

5 .Перенести 6 верхних пробирок с агаром из водяной бани.
к тепловому блоку. Температура теплового блока должна оставаться
между 48-50ºC.

6 . С помощью свежего наконечника пипетки перенесите 100
мл суспензии бактерий на каждую
из 6 верхних пробирок с агаром. Ненадолго перекатайте трубки между
ладони, как показано, перемешать, затем вернуться к теплу
блокировать. Отбросить подсказку.

7 .Начиная с пробирки 6, асептически перенесите 100
мл в верхнюю пробирку с агаром. Смесительная трубка
катаясь между ладонями. Быстро залить инокулированный
верхний агар по поверхности чашки Петри 6, наклоняя
тарелку, чтобы равномерно распределить. Дайте ему сидеть вертикально [крышкой вверх]
на прилавке, чтобы застыть.

8 . Вы можете использовать тот же наконечник для дозатора, чтобы продолжить
перелив по 100 мл каждого
от пробирки для последующего разбавления до верхней пробирки с агаром, если она
остается незагрязненным.[Если стерильность нарушена или если в
сомневаюсь, поменять наконечники.] После каждого переноса разведения
образец, перемешайте и вылейте верхний агар по поверхности
табличка с соответствующей маркировкой.

9. Когда все пластины затвердеют, они могут быть
сложены и склеены связкой. Убедитесь, что тарелки
четко обозначены дата, имена и т. д. Переверните тарелки
и инкубируйте при 35ºC в D234.

10 .Бляшки должны быть видны в течение нескольких часов.
Вы можете проверить свои номера утром в D234. Считать,
выберите пластину, содержащую от 30 до 300 пластинок. Подсчитайте
количество бляшек, затем умножьте на 10, затем умножьте на
величина, обратная разбавлению этой чашки, чтобы получить число
единиц образования налета на миллилитр. Если вы видите отчетливые
различия бляшек на тарелке, вы можете подсчитать
типы отдельно.Для этого используйте ручки разных цветов.
чтобы облегчить ваш подсчет. Пожалуйста, верните свои тарелки
поднос. Их снимут из инкубатора около 12
полдень и сохранен для обсуждения на следующей неделе. Знак будет
размещены, чтобы указать их местонахождение на случай, если вы захотите проверить
их позже.

Почему количество бляшек умножено на 10?

Запишите результаты в БОЕ / мл:

Покажи свои расчеты:

Селективная антимикробная активность клеточных литических ферментов в бактериальном консорциуме

О функциональной характеристике литических полисахаридных монооксигеназ (LPMOs) | Биотехнология для производства биотоплива

Открытие литических полисахаридных монооксигеназ (LPMOs; рис.1) коренным образом изменил наш взгляд на ферментативное превращение полисахаридов, в частности, таких трудно поддающихся лечению материалов, как хитин и целлюлоза. Повышающий эффект LPMOs на активность классических гидролитических ферментов был впервые описан в 2005 г. для хитина [1] и в 2007 г. для целлюлозы [2]. В 2010 году Vaaje-Kolstad et al. показали, что в то время эти загадочные «повышающие» белки катализируют окислительное расщепление гликозидных связей, что предполагает, что LPMOs могут быть центральными игроками в сети оксидоредуктаз, участвующих в конверсии биомассы [3, 4].LPMO представляют собой моноферменты меди [5, 6]. Медь связана в характерной гистидиновой связке (рис. 1), которая редко встречается в природе и, вероятно, придает LPMO их замечательную окислительную способность [5, 7, 8]. Реакция LPMO влечет за собой восстановление меди внешним восстановителем, после чего фермент реагирует либо с O ₂ [3, 9], либо с H ₂ O ₂ [10,11,12,13,14] до образуют мощные формы кислорода, которые могут гидроксилировать углерод C1 или C4 в ножницеобразной гликозидной связи [10, 15, 16, 17] (рис.2).

Рис. 1

Трехмерная структура типичного LPMO и его активного сайта. a Кристаллическая структура и b детали каталитического центра целлюлозно-активного семейства AA9 LPMO из гриба Thermoascus aurantiacus , Ta LPMO9A (также известный как Ta GH61A; [5], PDB ID : 2YET). Кристаллическая структура отображается в мультипликационном представлении. Остатки активного центра показаны в виде полосок с розовыми атомами углерода.Атом меди показан в виде золотой сферы, а молекулы воды, координированные атомом меди, показаны в виде сфер красного цвета. b Активный сайт крупным планом

Рис. 2

Схемы реакций LPMO. На двух панелях показаны схемы реакций для активности LPMO, вызываемой O ₂ и H _{2 2 , предложенной в a 2010 [3] и b 2017 [10]. Обозначение Cu (II) / Cu ((I), указанное над стрелками, относится к иону меди в активном центре и его степени окисления до инициирования каталитического цикла.Обратите внимание, что в реакции, инициируемой O 2 , доставка двух электронов необходима для каждого каталитического цикла, тогда как реакция, управляемая H 2 O 2 , требует только «затравочного» восстановления LPMO, которое однажды активируется, может проводить несколько реакций}

Характеристика LPMO сопряжена с множеством осложнений, начиная от продукции активных ферментов и заканчивая характеристикой их субстратной специфичности и кинетики. Одна конкретная проблема, хорошо известная из работы с другими окислительно-восстановительными ферментами, но, возможно, еще хуже для LPMO, касается множества возможных прямых и побочных реакций, которые могут иметь место при смешивании восстановителей, O ₂ и / или H ₂ O ₂ , нерастворимый, необязательно «чистый» субстрат, LPMO и небольшие количества свободной меди, которые могут изменяться в ходе реакции.Что касается последнего, кривые хода реакций LPMO часто нелинейны, что в большинстве случаев, вероятно, связано с окислительным повреждением ферментов [10]. Такое повреждение не только приводит к инактивации ферментов, но и к высвобождению меди в растворе, даже в «чистых» экспериментальных системах. Еще больше усложняет ситуацию то, что LPMO обладают оксидазной активностью, что означает, что в присутствии восстановителя они могут превращать O ₂ в H ₂ O ₂ [18, 19].

Поскольку LPMO являются углеводно-активными ферментами (CAZymes), они классифицируются в базе данных CAZy, которая классифицирует CAZymes на основе их последовательности [20].В системе CAZy LPMO классифицируются как вспомогательные виды деятельности (AA; [21]), и в настоящее время они составляют шесть семейств AA: AA9, AA10, AA11, AA13, AA14 и AA15. Наиболее изученными семействами LPMO являются AA9 и AA10.

Несмотря на значительный прогресс в области LPMO с 2010 года, функциональная характеристика этих многочисленных и интересных ферментов остается серьезной проблемой. В этой статье мы обращаемся к наиболее частым вопросам, связанным с производством и характеристиками LPMO. Мы фокусируемся на практических аспектах характеристики функциональных свойств, таких как специфичность субстрата, кинетика реакции и стабильность, и обращаем особое внимание на возможные подводные камни.Мы также вкратце обсудим возможную важность некоторых из этих ловушек для интерпретации недавних исследований природы со-субстрата LPMO, O ₂ и / или H ₂ O ₂ . Для получения подробной информации о методологиях, на которые мы ссылаемся, таких как анализ продукта с помощью масс-спектрометрии или жидкостной хроматографии, или фундаментальные исследования связывания меди, мы отсылаем к недавним исследовательским статьям и обзорам [6, 22,23,24,25,26, 27,28].

Производство активных LPMO

Большинство охарактеризованных LPMO были рекомбинантно продуцированы в Escherichia coli для бактериальных LPMO или дрожжах Pichia pastori s для грибковых LPMO, в то время как некоторые были продуцированы в грибковых организмах-хозяевах.Тот факт, что и альфа-аминогруппа, и боковая цепь N-концевого гистидина зрелого белка участвуют в связывании меди (рис. 1) и, таким образом, в катализе, ограничивает варианты экспрессии. Наиболее удобный способ получения ферментов с N-концевым гистидином — это экспортировать белки в периплазматическое пространство или культуральную среду с использованием соответствующих сигнальных пептидов. Даже при этом рекомендуется использовать протеомные технологии (т.е. фрагментацию белка трипсином и последующее секвенирование полученных пептидов с помощью масс-спектрометрии), чтобы проверить, правильно ли обработан сигнальный пептид и действительно ли N-концевой остаток действительно обработан. представляет собой гистидин, особенно при использовании экспрессии Pichia .LPMO, которые восстанавливаются в отсутствие субстрата и в присутствии O ₂ или H ₂ O ₂ , склонны к окислительному повреждению, особенно гистидинов активного центра (более подробно ниже). Это еще одна причина для проверки рекомбинантно продуцируемых белков с использованием методов протеомики; см. пример [29]. Следует отметить, что возможно, что смесь правильно и неправильно обработанных LPMO, с окислительным повреждением и без него, появляется в виде гомогенной полосы на геле SDS-PAGE, которая скрывает физическую (и функциональную) гетерогенность белка.

Гетерологичная экспрессия LPMO создает некоторые проблемы. Гликозилирование может происходить в линкерных областях некоторых мультидоменных белков актиномицетов [30, 31] и будет отсутствовать при экспрессии таких белков в E. coli . Большинство грибковых ферментов будут гликозилированы, и хотя гликозилирование также будет происходить во время экспрессии в P. pastoris , паттерны гликозилирования обычно будут отличаться от естественного хозяина. N-концевой гистидин LPMO грибов несет метилирование [5], и эта посттрансляционная модификация не будет происходить, когда эти ферменты продуцируются в P.pastoris , как показано кристаллическими структурами LPMO, продуцируемых Pichia (например, [32,33,34]), и анализом N-концевого пептида LPMO, продуцируемых Pichia , с использованием протеомических технологий [35]. Петрович и др. недавно показали, что многие функциональные свойства LPMO семейства AA9 из термофильного гриба Thermoascus aurantiacus, Ta LPMO9A, включая субстратную специфичность, окислительно-восстановительный потенциал, связывание меди и способность активировать O ₂ , не зависят от метилирования N-концевой гистидин [35].Единственное различие, обнаруженное при сравнении метилированного Ta LPMO9A, продуцируемого в Aspergillus , с неметилированным Ta LPMO9A, продуцируемым в P. pastoris , заключалось в том, что неметилированная форма показывала более низкую операционную стабильность (т. Е. более высокая степень инактивации ферментов во время реакций) и, следовательно, вероятно, имеет более низкую устойчивость к окислительному повреждению. Следует отметить, что две формы фермента имели несколько разные паттерны гликозилирования [35], и нельзя исключить, что это частично объясняет наблюдаемые различия в стабильности рабочих ферментов [35].Некоторые грибковые LPMO, описанные в современной литературе, экспрессируются в P. pastoris , и эти ферменты являются активными. Хотя имеющиеся в настоящее время данные показывают, что N-концевые гистидины LPMO, продуцируемых Pichia , не метилированы, необходимо отметить, что статус метилирования некоторых LPMO, продуцируемых Pichia , не анализировался.

Учитывая важность как N-концевой аминогруппы, так и боковой цепи His 1 (рис.1b), использование N-концевых меток для очистки невозможно, когда целью является получение активных LPMO, если только не существует эффективного способа удаления метки после очистки точно перед тем, что должно стать N-концевым гистидином. С-концевые метки очистки иногда могут быть приемлемыми, хотя в целом мы не рекомендуем использовать метки, поскольку они могут влиять на связывание со сложными сополимерными субстратами LPMO. С-концевые His-метки успешно использовались и давали активные LPMO [36, 37], однако мы убедились, что использование этой метки может создавать сложности при анализе фермента из-за его сродства к ионам металлов, включая медь.LPMO секретируются и, как правило, представляют собой стабильные белки с хорошим поведением; их очистка с использованием стандартных хроматографических методов, не основанных на метках, таких как ионный обмен, гидрофобное взаимодействие и эксклюзионная хроматография, как правило, довольно проста. Заявленные температуры хранения LPMO составляют 4, –20 и –80 ° C, но до сих пор не проводились исследования влияния температуры хранения на стабильность ферментов.

Для работы LPMO требуется медь. Из-за высокого сродства к меди, со значениями K _d порядка 1 нМ для Cu (I) и 50 нМ для Cu (II) [5, 6, 38], очищенные LPMO обычно содержат медь или собирать медь при инкубации с субстратами, содержащими этот ион металла.Для обеспечения полного насыщения медью возможно несколько подходов. Прямое добавление ионов Cu (II) в реакционные смеси обычно не является хорошей идеей, поскольку избыток этого переходного металла в реакционном растворе, который также содержит восстановитель и O ₂ или H ₂ O ₂ , будет способствовать разнообразные побочные реакции. Обычно используемый подход включает инкубацию LPMO с 1,5–3-кратным молярным избытком ионов Cu (II) с последующим удалением избытка меди с помощью эксклюзионной хроматографии [27, 39].Такая процедура часто используется в качестве заключительного этапа в стратегии очистки LPMO. Следует отметить, что растворы Cu (II) следует готовить в чистой воде и хранить при слабокислом pH (около 3–4), поскольку медь может выпадать в осадок в виде Cu (OH) ₂ в нейтральных или щелочных растворах.

Если кто-то намеревается оценить аффинность связывания меди LPMO, ионы двухвалентных металлов могут быть удалены из белка (и буфера) с помощью EDTA. Все буферы, используемые после обработки ЭДТА, должны быть свободными от металлов, что может быть достигнуто путем обработки, например.г., смола Chelex 100 [27, 40]. ЭДТА является эффективным хелатором двухвалентных металлов с константой ассоциации 10 ^18,78 M ^-1 для Cu (II) [41]. Удаление Cu (II) из активного центра LPMO осуществляется за счет игры на равновесии LPMO-Cu (II) ↔ апо-LPMO + Cu (II) ( K _d ~ 50 нМ; [6, 7, 40] , 42]) путем инкубации раствора LPMO-Cu (II) с избытком ЭДТА в течение достаточного времени. Обратите внимание, что чем ниже pH, тем менее эффективен EDTA в качестве хелатора Cu (II) из-за частичного протонирования карбоксильных функций.На практике в нашей лаборатории мы инкубируем раствор LPMO-Cu (II) с 10 мМ ЭДТА при pH ~ 6 в течение ночи при 4 ° C.

Долю атомов меди на молекулу LPMO можно оценить с помощью ЭПР или ICP-MS [27]. Однако не каждая лаборатория может иметь легкий доступ к такому оборудованию и / или обладать необходимыми знаниями для повседневного контроля. В качестве альтернативы можно использовать измерения флуоресценции, поскольку измерение флуоресценции происходит быстро и обычно требует небольшого количества белка, в то время как флуориметры широко доступны.Координация меди LPMO гасит его собственный сигнал флуоресценции [38, 43] до степени, которая зависит от окислительно-восстановительного состояния меди, Cu (II) является более сильным гасителем, чем Cu (I) [43]. Однако величина эффекта варьируется от LPMO до LPMO. Мы заметили, что AA10 обычно дают лучший отклик, чем AA9. На практике можно сравнить сигнал флуоресценции апофермента и фермента, насыщенного медью. Можно ли наблюдать переход из состояния Cu (II) в состояние Cu (I) (т.е.например, увеличение флуоресценции) можно оценить, посмотрев на эффект от добавления стехиометрических количеств хорошего восстановителя (например, аскорбиновой кислоты) [43]. Правильно приготовленный апо-LPMO не должен показывать увеличения флуоресценции. Другой альтернативой является измерение поглощения в УФ-видимом диапазоне, но для этого требуется гораздо большее количество фермента.

Основная характеристика активности LPMO с использованием полисахаридных субстратов

Существует множество способов оценки активности LPMO. Наиболее актуальные и информативные методы включают инкубацию с восстановителем и субстратом с последующим анализом растворимых продуктов (т.например, окисленные олигосахариды) масс-спектрометрией (МС) MALDI-TOF, которая является быстрой и простой, или высокоэффективной жидкостной хроматографией (ВЭЖХ), которая требует немного больших усилий. Важно, что всегда следует проводить контрольные реакции без добавления восстановителя, поскольку препараты LPMO могут быть загрязнены обычными гликозидгидролазами, такими как целлюлазы. Даже следовые количества таких загрязняющих ферментов могут иметь сильное влияние на профиль продукта, в частности, потому что реакции LPMO являются относительно медленными (см. Ниже).В реакциях без добавления восстановителя LPMO не будет активен, а это означает, что может быть обнаружена загрязняющая фоновая активность. Поскольку субстраты LPMO могут содержать некоторую восстанавливающую способность, контрольные реакции без добавления восстановителя не всегда могут полностью устранить активность LPMO, и окисленные продукты все же могут быть обнаружены. В таких случаях иногда может потребоваться провести дополнительные контрольные эксперименты, например, с использованием ЭДТА для отмены активности LPMO.

Как активность, так и стабильность LPMO зависят от типа и концентрации восстановителя, а свойства восстановителя зависят от pH [44,45,46], как обсуждается ниже.Общее впечатление от почти 10-летних исследований LPMO заключается в том, что аскорбиновая кислота обычно дает хорошие результаты в относительно широком диапазоне pH. В типичном «первом тесте» активности LPMO можно использовать 1 мМ аскорбиновую кислоту в качестве восстановителя при pH около 6. Выбор субстрата, очевидно, имеет большое значение, как подробно обсуждается ниже. Легкодоступные субстраты для первоначального тестирования включают Avicel, целлюлозу, набухшую фосфорной кислотой (PASC), полученную от Avicel [47], и коммерчески доступный α-хитин.Хитин-активные LPMO, как правило, наиболее активны в отношении β-хитина, который доступен для приобретения через такие компании, как France Chitine (Orange, Франция), или который может быть очищен из загонов кальмаров с помощью относительно простой процедуры очистки (см. [48] и ссылки в нем).

Хотя анализ продуктов с помощью МС иногда может дать количественное представление об активности фермента, МС в первую очередь является качественным методом, обеспечивающим быстрый и простой способ оценки активности и специфичности субстрата (последний более подробно обсуждается ниже).Массы C1- и C4-окисленных продуктов идентичны, но все же возможно получить информацию об окислительной региоселективности, как подробно обсуждается Westereng et al. в [25, 28]. Окисление по C4 дает 4-кето-сахар, который находится в равновесии с формой гемдиола (то есть гидратированным 4-кето-сахаром). Эти два варианта окисленных частиц обычно проявляются как отдельные натриевые аддукты. С другой стороны, лактон, полученный посредством C1-окисления, находится в равновесии с формой альдоновой кислоты (т.е.е., карбоксильная группа), которая доминирует при нейтральном pH. Эта форма альдоновой кислоты дает характерные и часто доминирующие сигналы MS из-за образования солей, обычно солей натрия. Эти «натриевые соли аддуктов натрия» имеют характерные массы из-за присутствия двух ионов натрия. Отсутствие таких солевых сигналов в спектрах, которые показывают окисленные частицы, убедительно указывает на то, что окисление происходит на C4. Существуют характерные сигналы MS для продуктов, которые окисляются с обоих концов, и, хотя эти сигналы обычно небольшие, они действительно появляются при анализе продуктов LPMO, которые могут действовать как на C1, так и на C4 (см.g., рис. S1 в исследовании Forsberg et al. [40]).

Важно отметить, что наиболее распространенными катионами, которые образуют аддукты с продуктами LPMO, являются натрий (Na ⁺ , 22,9897 Да) и калий (K ⁺ , 39,0983 Да). Атомные массы этих элементов отличаются друг от друга примерно на атомную массу кислорода (O, 15,9994 Да), и это может создать проблемы. Например, аддукт калия нативного олигосахарида (M + 39) будет иметь ту же массу, что и аддукт натрия соответствующего окисленного (M-2) и гидратированного (M + 18) олигосахарида (M-2 + 18 + 23). .Чтобы избежать этих осложнений, можно провести насыщение LiCl, что приведет только к аддуктам лития (Li ⁺ , 6,941 Да). Во избежание ложной интерпретации результатов необходимо обеспечить уровень насыщения, поскольку разница между атомными массами Li и Na также составляет прибл. 16 Да. Следует отметить, что приведенные выше соображения основаны на использовании MALDI-TOF MS, который легко доступен в большинстве лабораторий. Альтернативой может быть использование масс-спектрометров других типов (например,g., Orbitraps), которые предлагают настолько высокое разрешение, что о природе аддукта можно судить только по измеренной массе анализируемого вещества.

Стандартные методы ВЭЖХ для разделения окисленных хитоолигосахаридов (только C1-окисленные), основанные на хроматографии гидрофильного взаимодействия (HILIC) с УФ-детектированием, и окисленных целлоолигомеров (C1, C4 и дважды окисленные C1 / C4) , основанные на высокоэффективной анионообменной хроматографии с импульсным амперометрическим детектированием (HPAEC-PAD), очень хорошо разработаны, обеспечивая базовое разделение всех нативных и C1-окисленных растворимых продуктов LPMO ([3, 15, 22], см. Vu et al.[49] для хороших примеров для целлюлозы). C4-окисленные продукты, которые до сих пор наблюдались только для глюкановых субстратов, нестабильны в щелочных условиях, используемых в хроматографии, но дают достаточно хорошо разделенные характеристические пики, которые предоставляют информацию о длине продукта [24]. Важно отметить, что в щелочных условиях продукты, окисленные C4, превращаются в нативные олигомеры [24], что объясняет кажущееся высокое образование нативных продуктов C4-окисляющими LPMO. Вторая причина, по которой нативные олигосахариды могут быть обнаружены в реакциях LPMO, — это присутствие примесей гидролазы в партии фермента LPMO, как обсуждалось выше.Следует отметить, что стабильность продуктов, окисленных C4, вероятно, зависит от температуры, поэтому важно знать, как остановить реакции; кипячение использовалось [50], но не всегда может быть лучшим решением. Альтернативой является фильтрация для отделения фермента от нерастворимого субстрата.

Методы ВЭЖХ, аналогичные методам, разработанным для анализа природных и окисленных целлоолигомеров, также могут быть использованы для обнаружения продуктов LPMO, полученных из ксилоглюкана, глюкоманнана, глюкана со смешанными связями [51, 52] и ксилана [53, 54].Хотя хроматографический анализ легко выявит активность LPMO на гемицеллюлозных субстратах, подробная интерпретация профилей продуктов является сложной задачей, потому что: (i) в отличие от целлюлозы гемицеллюлозные полисахариды и более длинные олигосахариды часто водорастворимы, и, следовательно, реакции дают сложные смеси продуктов и хроматограммы ( по сравнению с хроматограммами, показывающими ограниченный набор растворимых олигомерных продуктов, которые могут появляться в реакциях с целлюлозой), и (ii) гемицеллюлозные олигосахариды имеют разнообразную структуру, и чистые стандарты обычно недоступны.Хроматографические профили можно частично упростить, пытаясь достичь конечных точек реакции, то есть точки, когда весь субстрат превращается в продукты с наименьшей возможной продолжительностью. В качестве альтернативы гидролиз продуктов LPMO с одним или несколькими подходящими GH может дать более простые хроматограммы (например, [55]; см. Также ниже).

Количественная оценка продукта требует стандартов и упрощения смесей продуктов. Последнее может быть достигнуто обработкой продуктов гликозидгидролазами, которые превращают олигомерные продукты LPMO в смеси окисленных моно-, ди- и тримеров, в зависимости от типа субстрата и используемых ферментов.Качественные и количественные стандарты целлоолигосахаридов, окисленных C1, могут быть получены ферментативно с использованием целлобиозодегидрогеназы (CDH), которая окисляет целлобиозу и более длинные целлоолигосахариды [56, 57] до их соответствующих альдоновых кислот (GlcGlc1A – Glc _n Glc1A), как в исх. [52, 58]. Β-глюкозидаза может использоваться для превращения продуктов окисления C1 в глюкозу и глюконовую кислоту (Glc1A), где последняя коммерчески доступна и может использоваться в качестве стандарта для окисленных продуктов [59].Следует отметить, что β-глюкозидазы не могут разрушать целлоолигосахариды, которые были окислены в положении C4.

Реакции разложения с современными коктейлями целлюлаз, содержащими несколько LPMO и целлюлазы, обычно приводят к двум окисленным продуктам, глюконовой кислоте и C4-окисленной целлобиозе (Glc4gemGlc) [50, 59, 60]. C4-окисленный стандарт димера был получен с использованием LPMO9C из Neurospora crassa [19] для разложения целлопентаозы до эквимолярных количеств Glc4gemGlc и целлотриозы, что позволяет косвенно количественно определить Glc4gemGlc путем определения количества целлотриозы [60].Хотя этот последний метод количественной оценки очень полезен, его следует использовать с большой осторожностью, поскольку, как обсуждалось выше, продукты окисления C4 нестабильны и страдают от разложения окисленных продуктов на колонке во время HPAEC-PAD [24, 50]. Таким образом, очень важно, чтобы стандарт и образцы обрабатывались одинаково (воздействие pH, температуры и т. Д.).

Стандарты окисленных хитоолигосахаридов со степенью полимеризации 1–6 были приготовлены с использованием хитоолигосахаридоксидазы AA7 из грибкового патогена Fusarium graminearum ( Fg ChitO; [61]) [39].Стандарты на продукты, полученные из других распространенных субстратов LPMO, таких как ксилоглюкан, отсутствуют.

Если у кого-то есть доступ к мощным коктейлям соответствующих гликозидгидролаз, не содержащих LPMO, можно также определить общее количество катализируемых LPMO расщеплений, а не только определение окисленных растворимых продуктов [62,63,64]. В этом случае после реакции LPMO весь материал в реакционной трубке превращается в короткие олигомеры, включая окисленные короткие олигомеры, которые элюируются с различными временами удерживания во время ВЭЖХ.Важно отметить, что соотношение между растворимыми и нерастворимыми участками окисления будет зависеть от установки реакции и будет меняться во время реакции. В эксперименте с использованием регенерированной аморфной целлюлозы в качестве субстрата Frommhagen et al. показали, что фракция нерастворимого субстрата содержала большинство окисленных центров на ранней стадии реакции и что степень солюбилизации окисленных центров со временем увеличивалась [63]. Loose et al. наблюдали аналогичные результаты для хитин-активных вариантов LPMO с низкой активностью [65].В экспериментах с Avicel [62] Courtade et al. показали, что доля солюбилизированных окисленных центров зависит от концентрации субстрата: чем выше эта концентрация, тем больше доля окисленных центров в нерастворимом субстрате. Очевидно, что анализ только растворимой фракции в реакциях LPMO приводит к различной степени недооценки активности LPMO.

Для повышения общего качества анализа активности стоит уделить некоторое внимание приготовлению реагентов.Одним из важных аспектов является минимизация присутствия следов металлов, которые могут способствовать самоокислению восстановителя и образованию активных форм кислорода. Восстановители, такие как аскорбиновая кислота, предпочтительно должны быть приготовлены в воде «отбор следовых количеств» (Merck), а исходные растворы должны быть разделены на аликвоты и заморожены при -20 ° C. Оптимально для каждого эксперимента должны быть свежеприготовленные растворы восстановителя. Мы рекомендуем промывать воду «отбор следа» газообразным азотом перед растворением восстановителя. Если нужно использовать H ₂ O ₂ , исходные разведения следует проводить в воде «отбор следа» в темноте, а растворы должны быть разделены на аликвоты и храниться при -20 ° C.Важно проверить концентрацию H ₂ O ₂ экспериментально, а не просто полагаться на информацию, указанную на этикетке бутылки.

Побочные реакции

Даже самые тщательно разработанные анализы активности будут иметь множество осложнений, которые необходимо учитывать при интерпретации экспериментальных данных, в зависимости от цели исследования. Эти сложности возникают из-за того, что побочные реакции почти неизбежны, особенно при использовании сложных субстратов, которые могут содержать восстанавливающие соединения или небольшие количества переходных металлов.Обратите внимание:

• Восстановитель может реагировать с O ₂ и / или с H ₂ O ₂ , если последний накапливается в реакционной смеси. Реакции между восстановителем и O ₂ могут приводить к образованию H ₂ O ₂ . Степень протекания этих реакций зависит от восстановителя (см., Например, [46]).

• Восстановленные LPMO, которые не связаны с субстратом, в аэробных условиях будут производить H ₂ O ₂ [18].

• Восстановленные LPMO склонны к окислительной (само) инактивации, независимо от того, инициируется ли реакция LPMO O ₂ [64, 65] или H ₂ O ₂ [10, 12]. Связывание с субстратом (т.е. высокая концентрация субстрата) защищает от инактивации; Концентрации субстрата могут значительно изменяться во время определенных экспериментальных установок (например, в исследованиях типа прикладной биотехнологии), как и стабильность LPMO.

• Хотя могут быть споры о природе истинного субстрата LPMO, нет никаких сомнений в том, что H ₂ O ₂ может запускать каталитическую реакцию для нескольких LPMO [10,11,12, 66]. Таким образом, по крайней мере для некоторых LPMO, различные уровни H ₂ O ₂ в реакционных смесях могут влиять на активность LPMO.

• H ₂ O ₂ может участвовать в процессах, которые могут повредить любой фермент в реакционной смеси, например.g., через реакции типа химии Фентона [67].

• Присутствие переходных металлов влияет на некоторые из перечисленных выше усложняющих процессов. На концентрацию переходных металлов могут влиять тип субстрата, возраст суспензии субстрата, степень деградации субстрата (которая может повлиять на высвобождение металла в растворе) и инактивация LPMO (которая приведет к высвобождению меди в растворе). решение).

• Концентрация растворенного O ₂ зависит от температуры [например, прибл. 8,3 мг / л (260 мкМ) при 25 ° C и 5,6 мг / л (175 мкМ) при 50 ° C, при атмосферном давлении, в пресной воде; 68].

Некоторые из этих сложностей обсуждаются более подробно ниже.

Заправка реакций LPMO с помощью H

₂ O ₂

На рисунке 2 показаны схемы реакций для O ₂ — и H ₂ O _{2 реакций LPMO под действием} .Для реакции, инициируемой O ₂ , требуются количества восстановителя, которые являются стехиометрическими по отношению к количеству образующихся продуктов, тогда как реакция, инициируемая H ₂ O ₂ , требует только затравочных количеств восстановителя. В последнем сценарии восстановитель по-прежнему будет необходим в ходе реакции, потому что LPMO иногда будет повторно окисляться (см. [13] для более глубокого анализа).

В данной области существуют некоторые разногласия относительно природы природного кислородного со-субстрата LPMO, O ₂ или H ₂ O ₂ .Тем не менее, в настоящее время в нескольких лабораториях с использованием различных LPMO (AA9, AA10, AA11) и различных субстратов хорошо задокументировано, что LPMO могут использовать H ₂ O ₂ в качестве вспомогательного субстрата и что H ₂ O Реакции, инициируемые _2, быстрее, чем реакции, инициированные O ₂ [10,11,12,13, 35, 50, 66, 69]. Было заявлено, что реакции, инициируемые H ₂ O ₂ , менее специфичны, чем реакции, инициируемые O ₂ , и приводят к продуктам с нетипичным типом окисления [11].По нашему опыту, работая с несколькими LPMO из разных семейств, с разной окислительной региоселективностью и с разными субстратами, при использовании H ₂ O ₂ не происходит снижения специфичности фермента (рис. 3). Мы не можем исключить, что в определенных реакциях образуются незначительные количества неспецифически окисленных продуктов, например, потому что LPMO, который становится окислительно поврежденным, медленно становится менее специфичным, как предполагают Hangasky et al. [11]. Также возможно, что субоптимальная комбинация LPMO-субстрат приводит к нарушенной конфигурации активного сайта в комплексе фермент-субстрат, который больше не направляет точно реактивные формы кислорода к их правильному назначению, как предполагают результаты, описанные Simmons et al.[70]. Однако не очевидно, что степень этих неспецифических процессов зависит от природы вспомогательного субстрата, как более подробно обсуждается ниже.

Рис. 3

Растворимые продукты, образующиеся при C4-окислении Nc LPMO из PASC или TXG в реакциях, подпитываемых O ₂ / аскорбиновой кислотой или H ₂ O ₂ . a , b Профили HPAEC-PAD продуктов, образующихся в реакционных смесях, содержащих 1 мМ аскорбиновой кислоты и 1 мкМ Nc LPMO9A (черная линия), 1 мкМ Nc LPMO9C (красная линия) или 1 мкМ Nc LPMO9D (синяя линия) и 2 мг мл ^-1 из a PASC или b TXG. c , d Профили HPAEC-PAD продуктов, образующихся в реакционных смесях, заправленных H ₂ O ₂ , содержащих 1 мкМ Nc LPMO9A (черная линия), 1 мкМ Nc LPMO9C (красная линия) или 1 мкМ Nc LPMO9D (синяя линия) и 2 мг / мл ^-1 c PASC или d TXG. В этих последних реакциях ~ 45 мкМ H ₂ O ₂ добавляли к реакциям каждые 15 мин; перед каждым добавлением H ₂ O ₂ добавляли ~ 12 мкМ аскорбиновой кислоты для обеспечения восстановления LPMO.Все реакции проводили в стандартных аэробных условиях, т.е. в присутствии приблизительно 250 мкМ O ₂ . Мечение целлоолигосахаридов в a и c основано на предыдущей работе [19]. Большой разброс во временах удерживания между a и c и между b и d обусловлен тем, что хроматограммы были получены в разные моменты времени; между ними были заменены обе колонки и части хроматографической системы.Эти цифры получены из неопубликованного исследования Petrovic et al., Которое будет опубликовано в другом месте

.

LPMO склонны к автокаталитической окислительной инактивации как в реакциях, инициированных O ₂ , так и в реакциях, инициированных H ₂ O ₂ [10, 50, 64, 65] (фиг. 4, 5), и степень инактивации будет зависят от типа и концентрации субстрата, как обсуждается ниже. Ключевая проблема при настройке реакций LPMO с добавленным H ₂ O ₂ состоит в том, чтобы избежать инактивации LPMO.Кинетические исследования хитин-активного LPMO показывают, что потенциально вредная реакция не связанного с субстратом восстановленного LPMO с H ₂ O ₂ на три порядка медленнее, чем продуктивная реакция с субстратом [12]. Тем не менее, при концентрациях H ₂ O ₂ , которые высоки по сравнению с количеством LPMO и количеством субстрата, в растворе будут происходить вредные реакции, приводящие к инактивации LPMO. В зависимости от типа реакции, перекорм H ₂ O ₂ , т.е.е. подача количества H ₂ O ₂ , которое превышает то, что LPMO могут обрабатывать продуктивным образом, может иметь дополнительные негативные последствия: восстановитель может истощиться из-за окисления H ₂ O ₂ и / или H ₂ O ₂ могут участвовать в других вредных процессах, описанных выше в разделе «Побочные реакции».

Рис. 4

Этот рисунок был адаптирован из [50]

Инактивация LPMO.Графики показывают образование C4-окисленной целлобиозы, наиболее часто встречающегося растворимого окисленного продукта, во время разложения Avicel с коммерческим коктейлем целлюлаз Cellic CTec2. a Образование продукта в реакциях, содержащих 5 мМ аскорбиновой кислоты и различные концентрации кислорода, что показывает, что более высокие концентрации кислорода дают более высокие скорости и более быструю инактивацию LPMO. b Образование продукта в анаэробных реакциях, содержащих 1 мМ аскорбиновую кислоту, с подачей H ₂ O ₂ .Скорость подачи H ₂ O ₂ в мкМ / ч указана на рисунке. Увеличение количества H ₂ O ₂ дает более высокие скорости и более быструю инактивацию фермента. Постепенное снижение уровня продукта связано с нестабильностью продукта.

Рис. 5

Рисунок был адаптирован из [10]

Окислительное повреждение Sc LPMO10C (CelS2). Анализ окисления белков с помощью протеомических методов показал, что семейство AA10 LPMO из актинобактерий Streptomyces coelicolor , Sc LPMO10C в условиях инактивации белков (присутствие восстанавливающего агента, но без субстрата) окисляется в активной зоне и рядом с ней. сайт, преимущественно на каталитических гистидинах h45 (на N-конце) и h244.Цветовой код указывает на степень окисления: высокая (красный), средний (оранжевый) и низкий (желтый). Для ароматических остатков, показанных серыми полосками, модификации не обнаружено. Серая фибрилла целлюлозы указывает сторону белка, с которой будет связываться субстрат. Ион меди показан оранжевой сферой. Код PDB для Sc LPMO10C — 4OY7.

Важно отметить, что скорости, полученные в реакциях с H ₂ O ₂ , как для продуктивного катализа, так и для инактивации ферментов, могут быть на несколько порядков выше, чем те, которые используются в классических реакциях LPMO с O ₂ и аскорбиновая кислота (интервал в секунду, а не в минуту; см. Ниже).Также стоит отметить, что как подробные кинетические исследования [12], так и выводы из других исследований, показывающих скорости реакции [10, 11, 50], предполагают, что значения K _m для H ₂ O ₂ находятся в очень близком состоянии. низкий микромолярный диапазон. Условия реакции необходимо соответствующим образом адаптировать; если исходные концентрации H ₂ O ₂ слишком высоки, можно закончить очень быстрой инактивацией LPMO, возможно, даже до того, как накопятся определяемые количества продукта.

В идеале H ₂ O ₂ следует подавать в реакционную смесь постепенно, как показано на рис. 4b, но это нелегко осуществить в реакциях лабораторного масштаба. В качестве альтернативы можно регулярно добавлять небольшие количества H ₂ O ₂ в реакционную смесь [10, 46], что может быть довольно утомительным и может давать «лестничный» профиль активности LPMO, поскольку будет повышение активности сразу после добавления свежего H ₂ O ₂ .

Другие методы измерения активности LPMO

В 2012 году Kittl et al.показали, что LPMO, которые восстанавливаются в присутствии O ₂ , будут производить H ₂ O ₂ , и предположили, что активность LPMO может быть обнаружена путем обнаружения продукции H ₂ O ₂ с использованием пероксидазы хрена / Amplex red проба [18]. Этот анализ широко используется в этой области и очень удобен для быстрой оценки (возможной) активности LPMO, особенно в более чистых образцах. Однако этот метод имеет несколько подводных камней, как недавно обсуждалось Breslmayr et al.[69], и должны использоваться только для качественной оценки. Рекомендуются контрольные реакции со свободной медью.

Важно отметить, что продукция H ₂ O ₂ не наблюдается, если анализ Amplex red настроен с присутствующим субстратом LPMO, и это может быть очень полезно при скрининге на предмет специфичности субстрата [19] (рис. 6) ). Однако в свете недавних открытий, касающихся способности LPMO использовать H ₂ O ₂ , некоторые общие рассуждения, относящиеся к этому типу экспериментов, нуждаются в пересмотре.Тот факт, что H ₂ O ₂ не обнаруживается в реакциях с субстратом, не обязательно означает, что H ₂ O ₂ не образуется, как обычно утверждается; это может просто означать, что произведенный H ₂ O ₂ расходуется в продуктивных реакциях LPMO, а не на окисление Amplex red пероксидазой хрена.

Рис. 6

Этот рисунок был первоначально опубликован в [19]

Накопление H ₂ O ₂ при инкубации Nc LPMO9C с восстановителем в отсутствие и в присутствии субстрата.Фермент (0,87 мкМ), который был первым LPMO, для которого была показана активность на олигомерных субстратах, инкубировали с 30 мкМ аскорбиновой кислоты, реагентами анализа Amplex red и 5 мМ указанного потенциального субстрата при pH 6,0 [19 ]. Артикул, без добавления субстрата. Контрольные эксперименты без восстановителя или LPMO не показали накопления H ₂ O ₂ . Обратите внимание, что более низкие уровни H ₂ O ₂ в реакционных смесях, которые содержат субстраты, расщепляемые ферментом (Glc ₅ и Glc ₆ ), не обязательно указывают на то, что H ₂ O ₂ не был произведен, как считалось в то время; также возможно, что H ₂ O ₂ действительно продуцировался, но не накапливался в той же степени, потому что он использовался LPMO при расщеплении субстрата; см. текст для более подробной информации.

Frandsen et al. описали элегантный метод измерения активности LPMO с использованием дериватизированной целлотетраозы, показывающий тушение FRET, которое облегчается при расщеплении этого олигомерного субстрата [23]. Это потенциально мощный и простой метод, который, однако, пока применим только для LPMO, действующих на растворимые субстраты. Кроме того, эти типы субстратов недоступны.

Действие LPMO снижает молекулярную массу и, следовательно, ведет к снижению вязкости (водо-) растворимых полисахаридов.Используя измерения динамической вязкости, Кодзима и др. [55] смогли количественно сравнить деполимеризующий потенциал двух LPMO с различной региоспецифичностью (C4-окисляющий Nc LPMO9C из Neurospora crassa и C1 / C4-окисляющий Gt LPMO9A-2 из Gloeo ) на ксилоглюкан и глюкоманнан. Примечательно, что измерения динамической вязкости активности LPMO могут быть более чувствительными по сравнению с HPLC и MALDI-TOF, которые обнаруживают только солюбилизированные олигосахариды, особенно когда сайты расщепления LPMO расположены далеко друг от друга на полимерном субстрате.

Vuong et al. разработали метод измерения окисления нерастворимой части субстрата, основанный на ковалентном связывании водорастворимого флуорофора с окисленными положениями внутри целлюлозных волокон [71]. Комбинируя этот анализ со стандартной высокоэффективной анионообменной хроматографией растворимых продуктов, можно получить полную картину образования продукта LPMO. Методы мечения C1-окисленных сайтов в нерастворимой целлюлозе также использовались Eibinger et al., Которые визуализировали адсорбцию флуоресцентного красителя SYTO62 на карбоксильных группах на поверхности целлюлозы с помощью конфокальной лазерной сканирующей микроскопии [72].

Используя тот факт, что C1-окисляющие LPMO образуют карбоксильные группы, Wang et al. разработали анализ адсорбции / десорбции ионов для измерения окисления на нерастворимом субстрате, вводимого С1-окисляющими целлюлозно-активными и хитин-активными LPMO [66]. Анализ основан на инкубации нерастворимого продукта реакции (например, частично окисленного хитина или целлюлозы) с Ni ²⁺ , который связывается с группами альдоновой кислоты, и спектрофотометрического определения оставшегося Ni ²⁺ в растворе с использованием комплексометрического индикатора. пирокатехол фиолетовый.Этот метод имеет свои ограничения, например, когда дело доходит до количественной оценки, но он очень прост и доступен. Следует отметить, что карбоновая кислота, образованная C1-окисляющим LPMO, находится в зависимом от pH равновесии с соответствующим 1,5-дельта-лактоном (щелочной pH благоприятствует карбоновой кислоте).

Интересно, что Breslmayr et al. разработали простой спектрофотометрический анализ, основанный на недавно обнаруженной пероксигеназной активности LPMO, для мониторинга видимой пероксидазной активности LPMO [69].После скрининга различных хромогенных моно-, ди- и трифенолов для разработки анализа был выбран 2,6-диметоксифенол (2,6-DMP). LPMO окисляет 2,6-DMP с образованием радикала, который димеризуется с образованием гидрокоэрулигнона, который затем окисляется LPMO с образованием коерулигнона, продукта с высоким коэффициентом экстинкции при 469 нм. Несмотря на то, что этот анализ прост и чувствителен, он может страдать от мешающих процессов, и поэтому его следует использовать с осторожностью, как это подробно обсуждается авторами.Кроме того, учитывая тот факт, что LPMO демонстрируют разную чувствительность к инактивации H ₂ O ₂ [10, 66, 69] и, вероятно, различаются тем, насколько хорошо они взаимодействуют с 2,6-DMP, эффективность этого анализа может варьироваться. между LPMO.

Субстратная специфичность

Есть несколько способов проверить субстратную специфичность LPMO, используя различные природные полисахариды, смеси природных полисахаридов [35, 53,54,55] или хромогенные субстраты [51, 73]. При использовании нехромогенных субстратов образование продукта можно оценить с помощью MALDI-TOF MS и / или жидкостной хроматографии.Использование MALDI-TOF MS, в принципе, позволяет быстро сканировать широкий спектр субстратов. Однако в случае сложных субстратов перекрывающиеся массы различных гексоз и пентоз будут создавать проблемы.

Первоначальный скрининг субстратной специфичности включает инкубацию LPMO с подлежащими тестированию субстратами в относительно высокой концентрации в присутствии восстановителя, который, как известно, хорошо работает для LPMO, обычно аскорбиновой кислоты в концентрации в диапазоне 1 мМ. Конечно, можно было бы выбрать установку реакции с H ₂ O ₂ , используя, например, 50 мкМ восстановителя и 100 мкМ H ₂ O ₂ .Хотя это может показаться простым, есть несколько подводных камней, которые необходимо учитывать и которые, по сути, заставляют нас полагать, что LPMO, охарактеризованные до сих пор, могут иметь деятельность, на которую не обращали внимания. Некоторые подводные камни:

1. Я.

   Как упоминалось выше и более подробно обсуждается ниже, LPMO страдают от самоинактивации (рис. 4). Степень этого процесса варьируется между LPMO и будет зависеть от природы и концентрации восстановителя и вспомогательного субстрата.Наиболее важно, что на инактивацию LPMO влияет присутствие расщепляемого субстрата [10, 62]. Вполне возможно, что иногда кто-то «пропускает» определенные действия, потому что фермент инактивируется до того, как будут произведены определяемые количества продуктов. Это может быть особенно верно, если реагенты смешиваются в неудачном порядке — следует избегать восстановления LPMO в отсутствие субстрата.

2. II.

   Как и предполагалось в ранних работах по LPMO [51, 74], множественность этих ферментов в определенных микроорганизмах, разлагающих биомассу, предполагает, что некоторые из них могут быть специализированы для воздействия на сополимерные структуры в лигноцеллюлозе, а не на конкретные «чистые» полисахариды, такие как как целлюлоза. Действительно, Frommhagen et al. и Couturier et al. обнаруживали активность LPMO в отношении ксилана, но только тогда, когда ксилан присутствовал вместе с целлюлозой ([53, 54], соответственно).Кроме того, мы наблюдали, что некоторые LPMO способны расщеплять ксилоглюкан, но только в присутствии аморфной целлюлозы в реакционной смеси (неопубликованные данные). Таким образом, при скрининге субстратной специфичности LPMO рекомендуется также протестировать некоторые комбинации субстратов.

3. III.

   Определенные виды деятельности LPMO могут не приводить к образованию растворимых продуктов и, таким образом, могут быть упущены из виду.Это подтверждается недавним открытием ксилан-активного LPMO, члена-основателя семейства AA14, который специфически действует на сильно тугоплавкие целлюлозные волокна, покрытые ксиланом [54]. AA14 представляют собой впечатляющий пример LPMO, предназначенного для воздействия на структуры сополимерной биомассы, которые могут дополнять другие LPMO. Действительно, AA14 увеличивал эффективность разложения предварительно обработанной древесной биомассы коктейлем целлюлазы, и делал это также, если этот коктейль был снабжен целлюлозоактивным LPMO.Таким образом, эта специфическая активность AA14 увеличивает эффективность процесса разложения сверх того, что может быть достигнуто с использованием целлюлозно-активных LPMO. Хотя Кутюрье и др. первоначально не обнаруживали растворимых продуктов, исследования ЯМР показали, что AA14 действует на ксилан. Последующие исследования с добавлением ксиланаз привели к обнаружению окисленных ксилоолигомеров. Таким образом, очевидно, что этот LPMO делает только очень ограниченное количество разрезов в очень определенных местах, что оставляет цепь ксилана с окисленным концом, прикрепленным к целлюлозе.По той же причине (т.е. ограниченное количество сокращений) Кодзима и др. [55] потребовалось использовать измерения вязкости, чтобы продемонстрировать, что AA9 LPMO способен деполимеризовать глюкоманнан коньяка, в то время как никакие олигосахариды не могут быть обнаружены с помощью анализов HPAEC или MALDI-TOF.

Другой причиной иногда использовать другие ферменты при скрининге субстратной специфичности может быть устранение неоднозначностей, возникающих из-за того, что MS не может различать различные общие гексозы и пентозы.В таких случаях может быть полезна ферментативная обработка определенными ферментами, действующими только на некоторые из возможных наблюдаемых типов продуктов.

Хотя вышеупомянутое касается качественного скрининга субстратной специфичности, следующим шагом в характеристике LPMOs, действующих на несколько субстратов, будут количественные исследования предпочтений субстратов. Хотя LPMO, действующие на несколько субстратов, известны с 2014 г. [19, 40, 51], насколько нам известно, в литературе не содержится надлежащей сравнительной оценки предпочтений субстратов для любого LPMO, за исключением нескольких попыток [51, 55].Такие сравнительные исследования могут быть основаны только на правильных кривых прогресса для каждого из субстратов и будут иметь все сложности, связанные с количественной оценкой активности LPMO, обсуждаемой в этом обзоре. Стабильность фермента, то есть устойчивость к окислительной самоинактивации, вероятно, будет варьироваться между субстратами, и можно задаться вопросом, в какой степени этот параметр должен быть включен при оценке природы «истинного» субстрата LPMO. Мы полагаем, что вполне возможно, что неприродные условия реакции, используемые в лаборатории, могут подтверждать активность LPMO в отношении субстратов, которые не являются естественными субстратами и которые могут не иметь биологического значения.

Роль (и) восстановителя

Из основополагающего исследования Kracher et al. [45] и работы других, ясно, что реакции LPMO могут подпитываться широким спектром восстановителей. Эти восстановители включают низкомолекулярные восстановители, такие как аскорбиновая кислота и несколько фенолов [3, 5, 26, 44, 75], ферменты, способные доставлять восстанавливающие эквиваленты, такие как целлобиозодегидрогеназа [15, 64, 76,77,78,79], лигнин и фрагменты лигнина [80,81,82,83] и световые системы [43, 84]. Понятно, что восстановитель (тип и концентрация) является основным определяющим фактором функциональности LPMO.Хорошие обзоры различных восстановительных систем можно найти в [45] и [26], тогда как Bissaro et al. [4] недавно рассмотрели возможное взаимодействие между LPMO и другими окислительно-восстановительными ферментами грибов.

Подробное обсуждение различных восстановителей и их потенциальной роли в катализе LPMO выходит за рамки этого обзора. Роль восстановителей в катализе LPMO определенно требует дальнейшего внимания и требует очень внимательного рассмотрения при интерпретации экспериментальных результатов. Один из больших вопросов в исследованиях LPMO иногда называют «второй электронной головоломкой»: если LPMO использует O ₂ и имеет ли LPMO только «пространство для хранения» одного электрона в виде его единственного иона меди. , как же тогда второй электрон доставляется к каталитическому центру в фермент-субстратном комплексе? В литературе даются различные возможные ответы на этот вопрос, в первую очередь основанные на существовании электронного канала (например,g., [85]) или возможность того, что LPMO рекрутирует электрон из одной из своих ароматических боковых цепей, как это наблюдалось в других окислительно-восстановительных ферментах [86, 87]. Тем не менее, нет консенсуса, и LPMO не демонстрируют сохраненных структурных особенностей, которые могли бы быть связаны с любым из предложенных сценариев. С точки зрения оценки эффективности восстановителя вопрос заключается в том, является ли доставка первого или второго электрона лимитирующим.

Открытие того, что H ₂ O ₂ может подпитывать реакции LPMO, потенциально проливает совершенно новый свет на роль восстановителя.В самом деле, предполагая, что H ₂ O ₂ является истинным сопутствующим субстратом LPMO, авторы этого обзора ранее предполагали, что в большинстве, если не во всех, условиях, использовавшихся до сих пор при оценке активности LPMO, производство ко-субстрата -субстрат H ₂ O ₂ , посредством LPMO и / или посредством прямых реакций между восстановителем и O ₂ , является фактором, ограничивающим скорость. Хотя это остается несколько спорным, стоит отметить, что сообщаемые скорости реакций LPMO, управляемых O ₂ , как правило, находятся в узком диапазоне 1–10 мин ^–1 , независимо от типа LPMO и независимо от субстрата. [4].Некоторые утверждают, что это указывает на то, что измеряемая скорость отражает процесс ограничения скорости, который аналогичен большинству этих реакций, которые могут представлять собой образование H ₂ O ₂ . Loose et al. показали, что скорость окисления хитина под действием CDH Sm LPMO10A (также известного как CBP21, семейство AA10 LPMO почвенной бактерии Serratia marcescens ) по существу идентична скорости, с которой CDH продуцирует H ₂ O ₂ в присутствии O ₂ в качестве единственного акцептора электронов [64].Если принять катализ на основе H ₂ O ₂ , эффективность различных восстановителей отражает, по крайней мере частично, способность стимулировать производство H ₂ O ₂ либо непосредственно, в растворе, либо в процессе. с участием LPMO, не связанных с субстратом. Следует отметить, что катализ LPMO на основе H ₂ O ₂ также требует восстановления и периодического повторного восстановления каталитического иона меди восстановителем.

Важно отметить, что изменение количества восстановителя влияет не только на эффективность LPMO, но и на возникновение нескольких побочных реакций, перечисленных выше.Таким образом, восстановитель будет влиять не только на окислительно-восстановительное состояние LPMO, включая концентрации O ₂ и H ₂ O ₂ , а также на окислительно-восстановительное состояние переходных металлов в реакционной смеси.

Совсем недавно, используя кинетику, Kuusk et al. исследовали роль восстановителя в разложении хитина под действием H ₂ O ₂ под действием Sm LPMO10A [13].

Самоинактивация LPMO

Как неоднократно упоминалось выше, LPMO чувствительны к автокаталитической окислительной инактивации, независимо от того, инициируется ли реакция O ₂ или H ₂ O ₂ (рис.4). Как показано на рис. 5, остатки, близкие к каталитической меди, в частности N-концевой гистидин, становятся окислительно поврежденными [10, 65]. Этот тип повреждения, вероятно, приводит к выделению меди в растворе, хотя это еще не было оценено экспериментально.

Накопленные данные ясно показывают, что этот тип повреждения происходит, когда восстановленный LPMO находится в растворе, где он может реагировать с O ₂ или H ₂ O ₂ в отсутствие субстрата, который обычно является мишень для генерируемых мощных форм кислорода.Это означало бы, что образовавшиеся окислительные частицы будут реагировать на что-то еще, например, на соседние боковые цепи аминокислот в белке, что действительно наблюдается. Соответственно, было показано, что более высокие концентрации субстрата и присутствие углеводсвязывающих модулей (CBMs) улучшают устойчивость LPMO к инактивации [58, 62], тогда как стабильность снижается при мутации поверхностных остатков, которые способствуют связыванию субстрата [58, 65] .

Мы подозреваем, что степень автокаталитического повреждения также будет зависеть от типа субстрата.Понятно, что связывание субстрата помогает формировать активный сайт LPMO. Связывание субстрата обеспечивает удержание в каталитическом центре, что приводит к точной пространственной ориентации активных форм кислорода, которая необходима для окисления субстрата и минимизации окисления ферментов [14, 88, 89]. Изучая связывание целло- и ксилоолигомеров с LPMO с помощью рентгеновской кристаллографии, Simmons et al. показали, что эти соединения, оба из которых расщепляются ферментом, связываются по-разному [70].Различные способы связывания приводят к разным конфигурациям каталитических центров в комплексе фермент-субстрат, как показано разными сигналами ЭПР, указывающими на различия в медном окружении. Таким образом, различные субстраты могут влиять на реакционную способность медного сайта, а также будут влиять на то, в какой степени возникающие окислительные формы кислорода ограничены одной единственной ориентацией, которая приводит к продуктивному катализу (т. Е. Отрыв атома водорода от положения C1 или C4. в подложке).По тем же причинам такое изменение связывания субстрата может также влиять на степень, в которой субстрат подвергается неспецифическому окислению, например, недавно описанному в [11].

Таким образом, для получения стабильных реакций без инактивации ферментов важно создать условия, в которых восстановленные LPMO проводят как можно меньше времени в отсутствие субстрата. Очевидно, что при настройке реакций реагенты необходимо смешивать в правильном порядке (например, субстрат / буфер, затем фермент, затем инкубация не менее 30 мин, чтобы установилось равновесие связывания, и, наконец, восстановитель, необязательно с последующим H _2). O ₂ , чтобы начать реакцию) и концентрации субстрата должны быть как можно более высокими.Чтобы получить наилучшие возможные кривые прогресса, можно попробовать несколько восстановителей в различных концентрациях. Ферментные доноры электронов, такие как CDH, который окисляет целлобиозу и более длинные целлоолигосахариды, или недавно описанная пирролохинолинхинон-зависимая (PQQ-зависимая) пираноздегидрогеназа из Coprinopsis cinerea ( fuc PDH), которая окисляет редкие моносахариды, такие как моносахариды. и 2-кето-d-глюкоза менее доступны, но имеют тенденцию давать стабильную кинетику в некоторых условиях [64, 79].Хотя нет четких рекомендаций относительно оптимального выбора низкомолекулярных восстановителей, свежеприготовленные растворы галловой кислоты, как правило, дают хорошие результаты в наших руках. Некоторые примечания о том, как лучше всего организовать реакции, инициируемые H ₂ O ₂ , описаны выше.

Кинетика LPMO

Из-за множества сложностей при анализе активности LPMO, соответствующие кинетические данные для этих ферментов недостаточны. В недавнем обзоре Bissaro et al. перечислили очевидные ставки LPMO, которые были опубликованы как ставки или которые могут быть выведены из опубликованных кривых прогресса [4].В соответствии с первоначальными выводами Vaaje-Kolstad et al. для хитин-активного Sm LPMO10A [3], опубликованные или рассчитанные скорости для реакций LPMO, управляемых O ₂ , удивительно низки и варьируются от 0,1 с ⁻¹ до менее 10 ⁻⁴ с ⁻¹ . Реакции LPMO, управляемые H ₂ O ₂ [10, 11] или системой легкий хлорофиллин-восстановитель [84], протекают намного быстрее, со скоростью в диапазоне 10 с ^-1 или даже выше.

Кинетические различия между реакциями, вызванными O ₂ — и H ₂ O ₂ , становятся еще больше, если принять во внимание значения K _m для вспомогательного субстрата.Изучение H ₂ O ₂ -управляемый катализ хитин-активным Sm LPMO10A, Kuusk et al. найдено k _cat 6,7 с ^-1 и K _m для H ₂ O ₂ 2,8 мкм. Этот тип значений дает каталитическую эффективность ( k _cat / K _m ) в порядке 10 ⁶ M ⁻¹ s ⁻¹ , которые обычно наблюдаются для ферментов, включая пероксигеназы [12].Кинетические исследования вызванного O ₂ разложения целлогексаозы под действием Mt LPMO9E, LPMO из гриба Myceliophthora thermophila , дали k _cat с 0,28 s ^{−90 m для O ₂ 230 мкМ [11]. Таким образом, в этом случае каталитическая эффективность составляет порядка 10 3 M −1 s −1 , т. Е. На три порядка ниже по сравнению с H ₂ O ₂ -приводимая деградация хитин.}

LPMO в преобразовании биомассы: некоторые соображения

LPMO вносят значительный вклад в эффективность современных коммерческих коктейлей целлюлаз, используемых для преобразования лигноцеллюлозной биомассы [50, 59, 60, 90,91,92]. Оптимизация ферментных коктейлей, включая оптимальное использование потенциала LPMO, выходит за рамки данной статьи, но необходимо отметить, что проблемы, связанные с исследованиями LPMO, становятся еще больше при работе с настоящими субстратами. По сути, любые возможные побочные реакции, перечисленные выше, будут происходить, и мы подозреваем, что инактивация ферментов является серьезной проблемой.

Эта сложность хорошо иллюстрируется работой Müller et al. [50], которые изучали разложение различных (лигно) целлюлозных субстратов с помощью Cellic CTec2 (коммерческий коктейль целлюлолитических ферментов, производимый Novozymes) при обеспечении реакций с H ₂ O ₂ . Исследования с «чистыми» субстратами, такими как Avicel, подтвердили важность LPMO в коктейле ферментов, поскольку выходы осахаривания глюкана были более чем на 30% выше в условиях, способствующих активности LPMO.Кроме того, использование H ₂ O ₂ было благоприятным по сравнению со стандартной реакцией, инициируемой O ₂ , давая более высокие активности LPMO и до 10% более высокие конечные выходы глюкозы. Однако при использовании менее чистых, богатых лигнином субстратов ситуация стала менее ясной, и улучшения при использовании H ₂ O ₂ были минимальными. Вероятно, это связано с тем, что лигнин и производные лигнина могут участвовать в различных окислительно-восстановительных реакциях, включая реакции с H ₂ O ₂ .

Одна интригующая проблема связана с тем фактом, что LPMO можно настроить на катализатор окисления полисахаридов намного быстрее, чем считалось ранее. Тем не менее, если посмотреть на появление продуктов LPMO во время разложения биомассы [50] и предположить, что около 15% белка в современных целлюлолитических коктейлях составляет LPMO ([60]; обратите внимание, что количество 15% на самом деле является только предположением с некоторыми основание в цитируемом исследовании), можно сделать вывод, что LPMO работают со скоростью намного ниже 1 с ^-1 . Тогда возникает вопрос: действительно ли мы используем все молекулы LPMO в коктейле целлюлаз? Или мы используем только часть LPMO, в то время как подавляющее большинство непродуктивных LPMO постепенно деактивируется?

Еще один момент, который следует учитывать при биопереработке, касается постепенного истощения субстрата по мере протекания реакции.Это истощение увеличивает шансы инактивации LPMO, как указано выше. Действительно, недавнее исследование Müller et al. [50] показали, что во многих тестируемых условиях активность LPMO прекращалась до окончания реакции. Таким образом, возможно, что ближе к концу реакции, когда, возможно, останется только наиболее стойкая часть субстрата и активность LPMO может оказаться наиболее необходимой, фактически активности LPMO не останется.

Литическая полисахаридмонооксигеназа CbpD способствует вирулентности Pseudomonas aeruginosa при системной инфекции

Штаммы бактерий и клеточные линии

Штаммы Pseudomonas aeruginosa (PA), использованные в исследовании, включали штаммы дикого типа (WTP), PA14 (UCBP), PA14 (UCBP) клинический изолят человека ⁸⁵ и его изогенный мутант PA14Δ cbpD (ΔCbpD), предоставленные проф.Хоган (Школа медицины Гейзеля в Дартмуте, США). Чистая делеция ΔCbpD была подтверждена секвенированием следующего поколения Illumina (MicrobesNG, http://www.microbesng.uk) при минимальном охвате> 50 × и с использованием считываний парных концов 2 × 250 п.н., а также путем сравнения с PA14. эталонная последовательность (NC_008463), используя опцию «Сопоставить с эталоном» в Geneious Prime 2019.0.4 (www.geneious.com). SNP и делеции в секвенированных геномах по сравнению с эталонным геномом были обнаружены с использованием функции Geneious Prime Find Variations / SNPs.E . Штаммы coli обычно выращивали в бульоне Лурия-Бертани (LB, BD Difco) при 37 ° C. Штаммы PA выращивали при 37 ° C в среде, обогащенной инфузией мозга и сердца (BHI, Oxoid), или в LB при 200 об / мин, если не указано иное. При необходимости добавляли ампициллин (Sigma), канамицин (Sigma), карбенициллин или (Alpha Aesar) в количестве 100, 50 или 300 мкг мл ^-1 соответственно, если не указано иное. Vibrio anguillarum NB10 (серотип O1) (предоставлен профессором Вольфом Ватцем, Университет Умео, Швеция) был выделен в Морском исследовательском центре Умео, Норрбин, Швеция, во время естественной вспышки вибриоза ⁸⁶ и выращен в триптиказо-соевом бульоне (TSB, Oxoid) при комнатной температуре (RT). Enterococcus faecalis V583, устойчивый к ванкомицину клинический изолят ^87,88 , выращивали в BHI при 37 ° C. S. aureus USA300-MRSA (TCh2516, ATCC BAA-1717) и продуцирующий ESBL уропатогенный Escherichia coli , выделенные из мочи, выращивали в BHI и LB при 37 ° C, если не указано иное.

Нейтрофилы были очищены из гепаринизированной венозной крови здоровых добровольцев с использованием одностадийного полиморфпрепарата (Fresenius Kabi Norge AS) посредством градиентного центрифугирования (информация об этическом разрешении представлена ​​в разделе «человеческая сыворотка / кровь»).Моноциты (THP-1) и клеточные линии HL-60 были приобретены в ATCC. HL-60 поддерживали в модифицированной среде Дульбекко Искова (IMDM) (Sigma) с добавлением 20% (об. / Об.) Фетальной бычьей сыворотки (FBS) (Invitrogen Life Technologies), пенициллина (100 единиц мл ^-1 ) и 100 мкг мл ^-1 стрептомицина (Biowest) в инкубаторе CO ₂ (5% CO ₂ ) при 37 ° C. Клетки THP-1 поддерживали в среде RPMI 1640 (Gibco) с добавлением 2 мМ L-глутамина (Gibco), 10% (об. / Об.) FBS, 4.5 г L ^-1 глюкозы (Gibco), 10 мМ HEPES (Gibco), 1,0 мМ пирувата натрия (Gibco) и 0,05 мМ 2-меркаптоэтанола (Sigma). Клетки поддерживали при плотности 4 × 10 ⁵ –1 × 10 ⁶ мл ^–1 и пассировали каждые 4–5 дней.

Конструирование векторов комплементации

Плазмиды и праймеры, использованные в этом исследовании, показаны в дополнительной таблице 5. Комплементационные конструкции были клонированы в челночный вектор E. coli — PA pGM931 ⁸⁹ (предоставлен Assoc.Проф. Федерика Бриани, Миланский университет, Италия). Все производные pGM931 реплицировали и выделяли из E.coli с использованием набора для выделения плазмиды GeneJET (Thermo Scientific) и трансформировали в ΔCbpD. Для конструирования плазмид pGM-CbpD и pGM-CbpD-His ₆ (содержащих полигистидиновую метку (метку His ₆ ) на С-конце белка) ген cbpD с его нативным промотором амплифицировали с помощью ПЦР. из геномной ДНК PA14 (WT) с праймерами CbpD-KpnI-FW и CbpD-SbfI-RV / CbpD-SfbI-His ₆ -RV и клонировали в pGM931, расщепленную ферментами рестрикции KpnI и SbfI (NEB), используя либо In -Набор для клонирования Fusion HD (Clontech) или двойное расщепление после лигирования.Помимо праймеров, используемых для амплификации, для проверки плазмиды использовали CbpD-Out-FW, CbpD-Int-RV и pGM-FW. Вектор комплементации pGM-CbpD, содержащий мутацию h229A в последовательности CbpD, был получен в отсутствие (pGM-CbpD _h229A ) или присутствие (pGM-CbpD _h229A-His ) С-концевой гексагистидиновой метки с использованием мутагенеза. и услуга клонирования, предоставляемая GeneScript.

Клонирование CbpD в

E. coli

Экспрессионные конструкции для продукции рекомбинантного CbpD (rCbpD _EC ) были созданы следующим образом: Оптимизированный по кодонам ген для E.coli (GenScript), кодирующая cbpD (остатки 1–389, UniProt ID; Q02I11), была амплифицирована (дополнительная таблица 5) для последующего клонирования в вектор экспрессии pNIC-CH (Addgene) путем клонирования, не зависящего от лигирования ⁹⁰ , который добавляет гекса-гистидиновую метку к С-концу белка. Для экспрессии белка конструкцию трансформировали в клетки E. coli One Shot ^® BL21 Star ^TM (DE3) (Invitrogen). Гены, кодирующие усеченные версии rCbpD _{, EC} , AA10 (остатки 1-210) и MX + CBM73 (остатки 211-389), были созданы с помощью ПЦР с использованием пар праймеров rCbpD-pNIC-FW / rCbpD-AA10-pNIC-RV и rCbpD. -MX / CBM73-pNIC-FW / rCbpD-pNIC-RV, соответственно, и клонировали в вектор pNIC, как описано выше.Ген CbpD, содержащий мутацию h229A, был получен с использованием службы мутагенеза GenScript, из которой был получен мутированный ген ( cbpD _h229A ). Мутировавший ген CbpD клонировали в вектор экспрессии pNIC, как описано выше, с получением векторов rCbpD _EC-h229A и rCbpD _EC -pNIC. Для экспрессии в E. coli вектор трансформировали в BL21 Star ^TM (DE3).

Экспрессия рекомбинантных вариантов CbpD в

E.coli (rCbpD _EC ) и PA (rCbpD _PA )

Экспрессию всех рекомбинантных вариантов CbpD (rCbpD _EC, rCbpD _EC-h229A , AA10 и CBM73 культивирования) осуществляли культивированием E .coli BL21 Star (DE3), содержащий соответствующую экспрессионную плазмиду в среде Terrific Broth (TB) с добавлением 50 мкг мл ^-1 канамицина в колбах объемом 1 л при 22-25 ° C с использованием биореактора LEX-24 (Harbinger Biotechnology ). IPTG добавляли до конечной концентрации 0.1–0,2 мМ, когда культура достигла ОП ₆₀₀ = 0,5–0,6 (перед переносом в биореактор LEX-24), и индукция длилась ~ 16 часов. Экспрессию всех рекомбинантных вариантов CbpD, меченных гистами, в PA ΔCbpD (rCbpD _PA и rCbpD _PA-h229A ) проводили в среде LB с добавлением 300 мкг мл ^-1 карбенициллина в 1 л колбах при 22-25 °. C с использованием биореактора LEX-24 (Harbinger Biotechnology). Для индукции промотора P _BAD в векторах на основе pGM931 к бактериальной культуре добавляли арабинозу (Sigma) до конечной концентрации 6.6 мМ с последующей инкубацией в течение ~ 16 часов.

Очистка rCbpD и усеченных вариантов

Все варианты rCbpD _EC и rCbpD _PA были очищены с использованием подхода периплазматической очистки, за исключением rCbpD _EC (MX + CBM73; подробности см. Ниже). Для периплазматической очистки клетки собирали центрифугированием в течение 10 мин при 8000 × g . Фракцию периплазмы, содержащую зрелый белок, экстрагировали из собранных клеток осмотическим шоком ⁹¹ .Полученные экстракты центрифугировали в течение 15 минут при 22000 × g и пропускали через фильтр 0,22 мкм перед очисткой белка. Периплазматические экстракты загружали в 5-миллилитровую колонку HisTrap ™ High-Performance (GE Healthcare), подключенную к системе очистки ÄKTA FPLC (GE Healthcare), и очистку проводили в соответствии с инструкциями производителя.

Для очистки rCbpD _EC (MX + CBM73) культуру собирали центрифугированием при 8000 × g и ресуспендировали в буфере для лизиса / связывания (20 мМ Tris-HCl pH 8.0) с последующим разрушением клеток обработкой ультразвуком с использованием ультразвукового процессора Vibra Cell (Sonics). Клеточный дебрис удаляли центрифугированием при 8000 × g и неочищенный экстракт пропускали через фильтр 0,2 мкм. Цитоплазматические экстракты загружали в колонку HisTrap ™ High-Performance (GE Healthcare), подключенную к системе ÄKTA Purifier FPLC (GE Healthcare), и очистку выполняли в соответствии с инструкциями производителя.

Примеси удаляли гель-фильтрацией с использованием хроматографической системы очистителя Äkta, работающей на исключительной колонке HiLoad 16/6016/600 Superdex 75 (GE Healthcare).Скорость потока была установлена ​​на 1 мл / мин, и использованный элюент представлял собой 15 мМ трис-HCl / 150 мМ NaCl, pH 7,5. Фракции, содержащие чистые полноразмерные или усеченные варианты rCbpD (оцененные с помощью SDS-PAGE), объединяли, концентрировали и заменяли буфер на 15 мМ Трис-HCl / 150 мМ NaCl pH 7,5, используя Vivaspin 20 (отсечка по молекулярной массе 10 кДа). ) центробежные концентраторы (Sartorius Stedim Biotech GmbH). Чистота белка составила более 95% для всех ферментов с использованием SDS-PAGE. Концентрации белка определяли либо с помощью анализа Брэдфорда (Bio-Rad), либо по оптической плотности при A280 с использованием теоретического коэффициента экстинкции (http: // web.expasy.org/protparam/). Концентрации очищенных белков всегда контролировались последним методом перед использованием белка в любом анализе, используемом в этом исследовании.

Вычислительные детали моделирования молекулярной динамики (МД)

Трехмерная модель гомологии CbpD была построена из аминокислотных остатков 26–389 с использованием сервера RaptorX ^92,93 . Наиболее вероятное состояние протонирования каждой титруемой боковой цепи аминокислоты в модели RaptorX CbpD оценивалось с использованием H + + сервера ⁹⁴ , а N-концевым His26 и His129, которые составляют гистидиновую скобку, было присвоено протонирование HIE и HID. состояния соответственно.Пары цистеина Cys39 / Cys52, Cys89 / Cys204, Cys160 / Cys176 и Cys358 / Cys367, по-видимому, образуют дисульфидные мостики и были переименованы в CYX. Наконец, в гистидиновую скобу был добавлен ион меди, и эта модель будет называться no-PTM. Для создания моделей посттрансляционно модифицированного CbpD аминокислотные остатки Ser, Thr и Tyr, которые были экспериментально идентифицированы ^25,35 как сайты фосфорилирования (рис. 1a, b), были заменены модифицированными остатками. В модели, названной PTM-1, эти остатки были заменены на S1P, T1P и Y1P (–HPO ₃ ^— ), а в PTM-2 на SEP, TPO и PTR (–PO ₃ ² ).

Силовое поле белка ff19SB ⁹⁵ и силовое поле гистидиновой скобки-Cu (I) ⁹⁶ были применены ко всем трем моделям при подготовке моделей для МД-моделирования. Для описания фосфорилированных остатков силовое поле phosaa10 ⁹⁷ было применено к моделям PTM-1 и PTM-2. Ионы натрия были добавлены к моделям для получения нейтральности заряда, и 38 дополнительных ионов натрия и хлорида были добавлены к модели без PTM, чтобы компенсировать большее количество зарядов в фосфорилированных моделях.Все три модели были сольватированы в усеченном октаэдре OPC water ⁹⁸ с минимальным расстоянием 12 Å до границы, в результате чего были получены модели, состоящие примерно из 275 000 атомов.

Эти модели были подвергнуты первому раунду из 3000 шагов минимизации энергии с 10 ккал-моль ^-1 Å ^-2 позиционных ограничений для всех, кроме атомов водорода, прежде чем продолжить второй раунд из 3000 шагов с 5 ккал-моль. ⁻¹ Å ⁻² позиционные ограничения на Cα-атомы только с использованием шлифовальной машины в AmberTools19 ⁹⁹ .Затем все системы были нагреты до 300 К в ансамбле NVT в течение 40 пс. Уравновешивание плотности проводили при 300 К в течение 0,5 нс при постоянном давлении 1 атм с использованием баростата Берендсена со временем релаксации давления 1 пс. На последнем этапе уравновешивания 100 нс, выполняемом в ансамбле NVT с использованием алгоритма слабой связи и постоянной времени 10 пс для регулирования температуры, расстояние до центра масс (COM) модулей AA10 и CBM73 было ограничено до 100 Å с помощью силовая постоянная 5 ккал · моль ⁻¹ Å ⁻² .После уравновешивания моделей no-PTM, PTM-1 и PTM-2, моделирование продолжалось еще 525 нс без каких-либо ограничений, с накоплением 262500 снимков на каждой траектории. Во всех симуляциях мы использовали временной шаг 2 фс, периодические граничные условия с отсечкой 10 Å для несвязанных взаимодействий и метод Эвальда с использованием сетки частиц (PME) для электростатики дальнего действия ¹⁰⁰ . Атомы водорода были ограничены алгоритмом SHAKE. Моделирование проводилось с использованием версии PEMEMD CUDA, включенной в AMBER18 ¹⁰¹ .Анализ производственных траекторий проводился с использованием модуля cpptraj , включенного в AmberTools19 ⁹⁹ и собственных скриптов Python.

Малоугловое рассеяние рентгеновских лучей

Анализ малоуглового рентгеновского рассеяния был проведен на канале BM29 ¹⁰² в Европейском центре синхротронного излучения (ESRF) в Гренобле, Франция (длина волны λ = 0,992 Å) . Интенсивность рассеяния регистрировалась как функция вектора рассеяния q = (4π / λ ) sin θ , где 2 θ — угол рассеяния, а λ — длина волны.Данные собирали в десяти кадрах по 1 с при 20 ° C в диапазоне q 0,00449–0,51787 Å ^–1 для серий концентраций 2,50, 1,25, 0,63 и 0,31 мг мл ^–1 rCbpD _EC в буфер, содержащий 15 мМ Трис-HCl pH 7,5 и 150 мМ NaCl. Аналогичным образом сам буфер измерялся в течение 10 с при тех же условиях. Дополнительные эксперименты при 24 ° C и 37 ° C были выполнены в Университете Осло на приборе Bruker NanoStar (RECX). В интенсивности рассеяния вносили поправку на электронный шум, рассеяние в пустой ячейке и чувствительность детектора.Интенсивности были откалиброваны в абсолютных единицах с помощью рассеяния H ₂ O в качестве стандарта, а вклад рассеяния от буфера вычитали с использованием программного обеспечения BsxCuBE ¹⁰² . Затем данные были экстраполированы до нулевой концентрации растворенного вещества с использованием программного обеспечения ALMERGE ¹⁰³ , и экстраполированные данные были использованы для последующего анализа данных. Сводка статистики сбора данных и анализа приведена в дополнительной таблице 2 (подготовленной в соответствии с рекомендациями, предложенными в исх. ¹⁰⁴ ) и дополнительный рисунок 4. Данные BioSAXS были депонированы в SASBDB с кодом доступа SASDK42, а данные и статистика SAXS из домашнего источника доступны через коды SASBDB SASDJQ5 (24 ° C) и SASDJR5 (37 ° C) . Функция распределения парных расстояний (из обратного преобразования Фурье ¹⁰⁵ ), радиус инерции (из анализа Гинье ¹⁰⁶ ) и объем Порода (из функции Дебая Порода ^107,108 )) были рассчитаны с использованием инструментов в . ПРИМУС ¹⁰⁹ из пакета ATSAS ¹¹⁰ .20 моделей с низким разрешением были рассчитаны с использованием ab initio определения формы с использованием программного обеспечения DAMMIF ¹¹¹ , а средняя модель была создана с помощью программного обеспечения DAMAVER ¹¹² и уточнена с помощью DAMMIN ¹¹³ . DAMMIF , DAMAVER и DAMMIN являются частью пакета ATSAS ¹¹⁰ . Модель RaptorX (рис. 1b) была подогнана к данным SAXS с использованием Pepsi-SAXS ¹¹⁴ , с тремя доменами, смоделированными как твердые тела.Полученная атомистическая модель была впоследствии наложена на ab initio модель DAMAVER с использованием SUPCOMB ¹¹⁵ (рис. 1c).

Анализ активности CbpD

Активность CbpD в отношении β-хитина оценивали, как описано ранее, с модификациями ⁸¹ , используя не содержащую металлов воду на всех этапах и приготовления буферов. Очищенный rCbpD инкубировали при насыщении с трех- или пятикратным молярным избытком меди (Cu (II) SO ₄ ) в натрий-фосфатном буфере (50 мМ, pH 6.0) в течение 30 мин при КТ. Избыток меди удаляли, пропуская раствор фермента через колонку PD MidiTrap G-25 (GE Healthcare), и собирали первый 1 мл (из 1,5 мл) белковой фракции, чтобы гарантировать отсутствие загрязнения медью. После этого белок заменили буфером на 15 мМ Трис-HCl / 150 мМ NaCl, pH 7,5. Растворы, содержащие насыщенный медью rCbpD, хранили до 7 дней при 4 ° C. Активность CbpD оценивали, инкубируя 10 мг / мл ^-1 β-хитина (France Chitin) с 1 мкМ белка в 200 мкл реакционной смеси, забуференной 20 мМ трис-HCL, pH 7.0 в присутствии 1 мМ аскорбата (Sigma) в качестве внешнего донора электронов, если не указано иное. Дополнительные доноры электронов, включая НАДН (Sigma; конечная концентрация 1 мМ) и пиоцианин (Sigma; конечная концентрация 10, 100, 1000 мкМ), последний в сочетании с аскорбатом (конечная концентрация 250 мкМ) в некоторых реакциях при наличии показаний. В реакциях, созданных для исследования предполагаемого переноса меди от азурина к CbpD, лишенному меди, активность CbpD оценивали реакциями, в которых 10 мг / мл β-хитина ^-1 инкубировали с 1 мкМ апо-CbpD (CbpD без меди ) в 200 мкл реакционной смеси, забуференной 20 мМ трис-HCL, pH 7.0. В эту реакцию добавляли пиоцианин (10, 100 и 1000 мкМ), 250 мкМ аскорбата в присутствии или в отсутствие 1 мкМ очищенного азурина из PA (Sigma, растворенный в воде, не содержащей металлов). Генерацию апо-CbpD проводили путем инкубации LPMO (10 мкМ) с 2 мМ EDTA в 15 мМ Трис-HCl / 150 мМ NaCl pH 7,5 в течение ночи с последующим добавлением 5 мМ MgCl ₂ (Sigma), 15 мин. инкубация при комнатной температуре и, наконец, пропускание раствора белка через колонку PD MidiTrap G-25, где первые две трети (т.е.е., 1 мл) белкового элюата собирали. Раствор, содержащий апо-CbpD, хранили при 4 ° C до использования. Все ферментные реакции инкубировали при 37 ° C в термомиксере Eppendorf Comfort Thermo-Mixer при 800 об / мин. Образцы собирали в указанный момент времени (например, 0,5 или 2 ч), центрифугировали при 10000 × g , и супернатант немедленно фильтровали с использованием фильтра 0,22 мкм. Продукты реакции анализировали методом UPLC (Agilent) с использованием колонки для хроматографии гидрофильного взаимодействия (HILIC) длиной 150 мм (Acquity UPLC BEH amide, 1.7 мкм). Объем вводимой пробы составлял 5 мкл, скорость потока 0,4 мл мин ^-1 . Градиент был следующим: 74% ACN (A), 26% 15 мМ Tris-HCl pH 8,0 (B), выдержка в течение 5 минут, затем 3-минутный градиент до 62% A, 38% B. 2-минутный градиент к исходным условиям (74% A, 26% B) и последующая работа в этих условиях в течение 2 минут. Для анализа ex vivo использовали rCbpD _PA «как есть» без насыщения медью. Все данные ВЭЖХ были собраны и проанализированы с помощью программного обеспечения Chromeleon (версия 7.2,9; Thermo Scientific).

Анализ связывания CbpD

Анализ связывания выполняли путем инкубации 10 мкМ rCbpD _PA , rCbpD _PA-h229A , AA10 (только модуль AA10) и MX + CBM73 (только домены модуля X и CBM73) с 10 мг · мл ^-1 ß-хитина в 20 мМ трис-HCL, pH 7,0. Реакции инкубировали при 22 ° C в термомиксере Eppendorf Comfort Thermo-Mixer при 800 об / мин. Образцы собирали в различные моменты времени, центрифугировали при 16000 × g , и 2 мкл образца использовали для определения концентрации белка с помощью Nanodrop (A280).Количество белка в образцах было представлено в процентах по отношению к контрольному образцу, последний произвольно установлен на 100% несвязанный.

Анализ микроматрицы гликанов

Рекомбинантные CbpD (rCbpD _PA и rCbpD _EC ) были проверены на связывание гликанов с библиотекой из 585 природных и синтетических гликанов млекопитающих (версия 5.2) в 15 мМ Трис-HCl pH 7,5, 150 мМ NaCl в конечных концентрациях 5 или 50 мкг / мл от Core H (Консорциум функциональной гликомики (http: // www.functionglycomics.org), как описано ранее ¹¹⁶ . Вариант CbpD, очищенный от PA (rCbpD _PA ), использовали без добавления меди (активность белка была проверена перед отправкой), тогда как rCbpD _EC подвергали скринингу в присутствии 25 мкМ Cu (II) SO _{. 4.} Гликаны, несущие амино-линкер, напечатали на химически модифицированных ( N -гидроксисукцинимид-активированных) предметных стеклах стеклянных микроскопов. Результаты представлены в виде средних относительных единиц флуоресценции (RFU) (дополнительные данные 1).

Микромасштабный термофорез (MST)

MST-анализ выполняли с использованием системы Monolith NT.115 (NanoTemper Technologies). Таким образом, 50 нМ His-tagged rCbpD _PA метили с использованием набора Monolith NT His-Tag Labeling Kit RED-tris-NTA в соответствии с протоколом поставщика (NanoTemper Technologies). Все измерения проводились в стандартных капиллярах (NanoTemper Technologies) при 25 ° C с использованием 60% мощности светодиода и 20%, 40% или 60% мощности MST. Время включения и выключения лазера было установлено на 30 с и 5 с соответственно.Гексаа- N -ацетилхитогексаоза (NAG ₆ ) (Megazyme) использовали в конечной концентрации 1 мМ.

Кривые роста бактерий

PA14 и ΔCbpD выращивали в течение ночи в 5 мл LB. На следующий день бактерии промывали PBS, доводили до OD ₆₀₀ 0,4. После этого бактерии разбавляли 1: 100 в BHI, LB, RPMI (без фенолового красного) с добавлением 10% термоинактивированной FBS. Если указано, WT PA и ΔCbpD выращивали в M9 (с добавлением 2 мМ MgSO ₄ и 0.1 мМ CaCl ₂ ), где сукцинат (Millipore) заменял глюкозу в качестве единственного источника углерода при конечных концентрациях 5 мкМ и 40 мМ. Бактерии переносили в 96-луночный микротитровальный планшет (Corning Inc.) в общем объеме 150 мкл. Рост контролировали при 37 ° C путем измерения OD ₆₀₀ каждые 15 мин с использованием Synergy h2 Hybrid Reader (BioTek) или многомодового микропланшетного ридера Varioskan ^TM LUX (Thermo Scientific). Встряхивание производили за 15 с перед каждым считыванием. Средний контроль был включен в качестве фона.

Анализ уничтожения перекиси водорода

WT PA (PA14) и ΔCbpD выращивали в течение ночи в LB. На следующий день бактерии разбавляли 1: 100 и повторно выращивали в LB до фазы среднего экспоненциального роста. Бактерии промывали PBS и инкубировали с различными концентрациями (0, 1, 10, 100 и 1000 мМ) H ₂ O ₂ в RPMI с добавлением человеческого сывороточного альбумина (HSA) при 37 ° C в течение 10 минут в 96-луночный микропланшет с конечным объемом 200 мкл. Выживаемость бактерий оценивали серийным разведением с последующим посевом на чашки с агаром LB / BHI с последующей инкубацией в течение ночи при 37 ° C и подсчетом колоний.

Приготовление нормальной человеческой сыворотки (NHS) и реагенты

Для приготовления объединенной NHS кровь была взята у нескольких здоровых добровольцев (см. «Этическое одобрение») и позволила свернуться в течение 10–15 минут при комнатной температуре. После центрифугирования (10 мин, 2000 × г ) сыворотку немедленно собирали, объединяли и хранили при -70 ° C. Инактивированная нагреванием (HI-NHS) сыворотка была получена путем инкубации сыворотки в течение 30 мин при 56 ° C на водяной бане. Нормальная человеческая сыворотка и сыворотки с дефицитом компонентов комплемента также были приобретены у компании Complement Technology.Очищенный рекомбинантный ингибитор комплемента Ornithodoros moubata (OmCI) ¹¹⁷ был предоставлен профессором Ройаккерсом (Университетский медицинский центр Утрехта, Нидерланды).

cbpD профиль экспрессии

Экспрессию cbpD в PA14 (WT) оценивали с помощью цифровой ПЦР с каплями ^TM (ddPCR ^TM , Bio-Rad). Экспрессию cbpD оценивали во время роста в LB и M9 _PA , который представляет собой среду M9 (Gibco) с добавлением 0.5% (мас. / Об.) Казаминокислоты (Difco), 0,2% (мас. / Об.) Глюкозы (Sigma), 2 мМ MgSO ₄ (Sigma) и 0,1 мМ CaCl ₂ (Sigma). Ночную культуру WT разводили 1: 100 в M9 _PA и инкубировали при 37 ° C в условиях встряхивания. При достижении OD ₆₀₀ = 0,6 к бактериальным культурам добавляли нормальную человеческую сыворотку (NHS, 10% об. / Об.) (M9 _PA ) и инкубацию продолжали в течение 30 мин. Чтобы получить более полное представление о влиянии сыворотки на экспрессию генов lpmO у других патогенов, необходимо провести ночные культуры V.anguillarum и E. faecalis , выращенные в TSB и BHI, разводили в M9 _VA (среда M9 с 1% NaCl (мас. / об., Sigma), 0,2% (мас. / об.) казаминокислот и 0,5% (мас. / v) глюкоза) и LM17 _EF (1,25 г л ^-1 Matrix Fish Peptone (Sigma), 1,25 г л ^-1 Экстракт бакто-дрожжей (BD Difco), 0,25 г л ^-1 аскорбиновая кислота ( Sigma), 0,125 г л ^-1 MgSO ₄ (Sigma), 9,5 г л ^-1 глицеринфосфат динатрия (Sigma), 0,025 г л ^-1 MnSO ₄ (Sigma) соответственно.При достижении OD ₆₀₀ = 0,6 в бактериальные культуры добавляли 10% (об. / Об.) Объединенную сыворотку лосося (SS), и культуры инкубировали еще 30 мин. Сыворотка лосося была получена из 5 Salmo salar (размером ~ 1–1,5 кг), которые хранились в рыбной лаборатории Норвежского университета естественных наук. Рыбу умерщвляли резким ударом по голове перед взятием крови в негепаринизированные пробирки. Клетки собирали, немедленно ресуспендировали в растворе для защиты РНК (Qiagen) и дополнительно обрабатывали для анализа экспрессии генов.Экстракцию РНК проводили с использованием мини-набора RNeasy (Qiagen) с начальной стадией лизиса в TE-буфере, содержащем лизоцим (Sigma). Далее образцы обрабатывали расщеплением HL-dsDNase (ArcticZymes) в соответствии с инструкциями производителя. Целостность и количество РНК определялись Nanodrop. Обратную транскрипцию общей РНК выполняли на 100 нг РНК с использованием iScript ™ Reverse Transcription (RT) Supermix (Bio-Rad) в соответствии с рекомендациями производителя. Цифровой ПЦР-анализ капель проводили с использованием EvaGreen ddPCR ™ (Bio-Rad) в соответствии с рекомендациями производителя.Анализ проводили с использованием праймеров для обнаружения cbpD, lpmO _VA и lpmO _EF (дополнительная таблица 5). В каждую реакцию анализа, не содержащую матрицы или обратной транскриптазы, контроли включали в качестве отрицательных контролей.

Анализ бактериального протеома

Ночные культуры WT и ΔCbpD в LB разводили LB, RPMI / HSA (0,05%) и RPMI / HSA (0,05%) с добавлением 1% человеческой сыворотки в трех экземплярах с последующей инкубацией при 37 ° C при встряхивании.Для поддержки роста бактерий к культурам RPMI добавляли 10% LB. Образцы собирали в экспоненциальной фазе. После этого к образцам немедленно добавляли 1 × PhosSTOP ^TM (Roche), 1 мМ фенилметилсульфонилфторид (PMSF, Sigma) и 1 × полные ингибиторы протеазы, не содержащие мини-EDTA (Roche). Осадки клеток и супернатанты разделяли центрифугированием (4500 × g , 15 мин, 4 ° C). Супернатант концентрировали с использованием колонки 3000 кДа (Amicon) (20x). Осадок бактериальных клеток ресуспендировали в 20 мМ Трис-Cl (pH 7.5), 0,1 М NaCl, 1 мМ ЭДТА, 1 × полные мини-ингибиторы протеазы без ЭДТА и лизоцим (0,5 мг · мл ^-1 ) до концентрации ~ 2 × 10 ¹⁰ колониеобразующих единиц (КОЕ ) / мл (посредством измерения OD600) и клетки разрушали обработкой ультразвуком (20 ×, 5 дюймов — 5 дюймов, 27% ампер) в условиях ледяного холода, клеточный дебрис удаляли центрифугированием (4500 × г , 30 мин, 4 ° C).

Белки обрабатывали на SDS-PAGE (10% гель Mini-PROTEAN, Bio-Rad Laboratories) в течение 1 см и затем окрашивали кумасси бриллиантовым синим R250.Гель разрезали на несколько срезов, белки восстанавливали, алкилировали и расщепляли в геле, как описано ранее ¹¹⁸ . Пептиды солюбилизировали в 0,1% (об. / Об.) Трифторуксусной кислоте (TFA) и обессоливали с использованием наконечников ZipTips C ₁₈ (Merck Millipore) в соответствии с инструкциями производителя. Пептидные смеси анализировали с использованием системы нано-ВЭЖХ-МС / МС, как описано ранее ¹¹⁸ . Система состояла из гибридного квадрупольно-орбитального масс-спектрометра Q-Exactive (Thermo Scientific), оснащенного источником ионов с нано-электрораспылением.Масс-спектральные данные были получены с использованием Xcalibur (v.2.2 SP1). Необработанные файлы MS обрабатывали с помощью пакета программного обеспечения MaxQuant (версия 1.6.3.3.) Для количественного определения без меток (LFQ) и идентификации белков ¹¹⁹ . Трипсин был установлен как протеолитический фермент, и было разрешено два пропущенных расщепления. Функция «совпадения прогонов» в MaxQuant была применена с параметрами по умолчанию. Данные были отфильтрованы до 1% уровня ложного обнаружения пептидов и белков (FDR) с использованием подхода обратной базы данных «цель-ловушка» ¹²⁰ .

Для определения значимо изменяющихся белков между изогенными мутантами, ΔCbpD и штаммами WT (PA14), между каждой парой белков был проведен попарный тест t (дополнительные данные 2). Дисперсия оценивалась с помощью теста F , чтобы убедиться, что использовались правильные статистические допущения. Для учета множественных сравнений была применена поправка Бенджамини – Хохберга с вероятностью ложного обнаружения 5%. Дифференциально распространенные белки определяли по значениям q ≤ 0.05 и кратное изменение ≥1,5 (log ₂ = 0,58) (Дополнительные данные 3). Кроме того, белки, которые были идентифицированы либо в штамме ΔCbpD, либо в штамме WT, но не в другом, также считались значимыми. Эти белки не имеют ассоциированного значения складчатости или q , скорее они аннотированы как «вверх» или «вниз», регулируемые в штамме ΔCbpD по сравнению с WT (дополнительные данные 4). Используя список белков со значительным повышением и понижением регуляции (дополнительные данные 3 и 4), гипергеометрическое обогащение использовали для расчета путей KEGG, которые обогащены штаммами ΔCbpD и WT.Значения P из гипергеометрического расчета были подвергнуты коррекции FDR (Benjamini – Hochberg), а пути со значениями q ≤ 0,05 были определены как обогащенные. Для каждого из этих обогащенных путей рассчитывалась оценка обогащения. Анализ главных компонентов (PCA) использовался для уменьшения размерности многомерных данных до двух основных компонентов, чтобы кластеры данных могли быть визуализированы графически. Для этого было реализовано вменение K-ближайших соседей (kNN) для заполнения пропущенных значений, когда это возможно.Если значения для всех реплик образца отсутствовали, значения заменялись минимальным обнаруженным значением для этой реплики. Для дальнейшего изучения группировки штаммов и белков была проведена агломеративная иерархическая кластеризация (дополнительные данные 5). MATLAB R2018b использовался для всех графиков и анализов.

Эффект сукцината (Millipore) на уровни экспрессии CbpD оценивали с помощью безметки количественной протеомики. Ночную культуру WT (PA14) разбавляли и повторно выращивали в M9 с добавлением 0.2% (мас. / Об.) Глюкозы (Sigma), 2 мМ MgSO ₄ (Sigma), 0,1 мМ CaCl ₂ (Sigma). При достижении OD ₆₀₀ = 0,4 к образцам добавляли сукцинат в конечной концентрации 0, 0,5 мкМ, 5 мкМ, 5 мМ и 50 мМ. Образцы инкубировали при 37 ° C при встряхивании и собирали при достижении OD ₆₀₀ = 0,7–0,8. После этого к образцам немедленно добавляли 1 мМ PMSF и 1 × полные ингибиторы протеазы, не содержащие мини-EDTA. Осадки клеток и супернатанты разделяли центрифугированием (4500 × g , 15 мин, 4 ° C).Бактериальный осадок обрабатывали и анализировали протеомными методами, как описано выше.

Для анализа PTM на CbpD очищенный rCbpD _PA хранился в 20 мМ трис-HCl pH 8, восстановлен DTT (Sigma; 10 мМ), а затем алкилирован йодацетамидом (Sigma; 15 мМ) в темноте. в течение 30 мин при комнатной температуре. Переваривание проводили с соотношением фермент / белок 1:40 с использованием трипсина или химотрипсина в течение ночи при 37 ° C. Реакцию останавливали TFA (Fluka) до конечной концентрации 1%.Пептид обессоливали с помощью наконечника C18 ZipTips (Merck) в соответствии с рекомендациями производителя и анализировали с помощью масс-спектрометрии, как описано выше. Для анализа PTM на CbpD использовали программное обеспечение PEAKS ¹²¹ , используя как трипсин, так и химотрипсин в качестве ферментов, и с полеспецифическим расщеплением, допускающим три пропущенных расщепления. Карбамидометилирование было задано как фиксированная модификация, в то время как фосфорилирование (STY), ацетилирование (K) и метилирование (KR) допускались как переменные модификации.Кроме того, мы включили окисление метионинов и дезамидирование аспарагинов и глутаминов; однако они были включены только для пептидного покрытия, а не для анализа PTM. Результаты были отфильтрованы до 0,1% FDR (- ₁₀ log P > 32,9), и только модифицированные пептиды с AScore> 20 считались действительными.

Анализ выживаемости бактерий в крови

Жизнеспособность PA в цельной крови человека оценивали, как описано ранее ¹²² с модификациями.Бактерии выращивали в LB, дважды промывали 1 × PBS и ресуспендировали в RPMI / HSA. Кровь от здоровых доноров собирали в пробирки, содержащие гирудин (SARSTEDT или Roche), и смешивали (160 мкл) с PA (∼2–4 × 10 ⁶ КОЕ мл ^–1 ), MRSA USA300 (∼3 × 10 ^{). 6} КОЕ мл ^-1 ) или E. coli ESBL (∼3 × 10 ⁶ КОЕ мл ^-1 ) в RPMI 1640 (Gibco, Life Technologies, Великобритания), содержащей 0,05% сывороточного альбумина человека (HSA ) (Sanquin / предоставлено ван Зорге) (RPMI / HSA).Когда указано, к образцам добавляли rCbpD _PA в конечной концентрации 20 мкг мл ^-1 . Инфицированные образцы (конечный объем 200 мкл) инкубировали в течение 1–3 ч при 37 ° C на ротаторе. Затем клетки крови лизировали путем добавления 800 мкл H ₂ O (ледяной) с 0,3% (мас. / Об.) Сапонина (Sigma), интенсивно перемешивали на вортексе и немедленно высевали. Для MRSA была включена 10-минутная стадия обработки ультразвуком на водяной бане после лизирования. Выживаемость бактерий оценивали серийным разведением с последующим посевом на чашки с агаром LB / BHI с последующей инкубацией в течение ночи при 37 ° C и подсчетом колоний.

Фагоцитоз цельной крови

Для флуоресцентного мечения бактерии выращивали в 5 мл LB, дважды промывали 1 × PBS с последующим ресуспендированием в 5 мл 0,1 н. Карбоната натрия (Sigma), содержащего 0,5 мг мл ^-1 изотиоцианат флуоресцеина ( FITC; Sigma) в течение 1 ч при комнатной температуре в защищенном от света месте. Бактерии тщательно промывали PBS (три раза), ресуспендировали в RPMI / HSA до OD ₆₀₀ , равной 1,0, и повторно разводили в пять раз в RPMI / HSA. После реакции мечения 20 мкл меченного FITC WT или ΔCbpD инкубировали в течение 20 мин при 37 ° C со свежевыделенной человеческой кровью (160 мкл), содержащей гирудин, для предотвращения коагуляции.Когда указано, к образцам добавляли rCbpD _PA в конечной концентрации 20 мкг мл ^-1 . Реакцию фагоцитоза останавливали с использованием лизирующего раствора клеточного сортировщика, активируемого флуоресценцией (BD Biosciences). Образцы дважды промывали RPMI / HSA, ресуспендировали в том же растворе с добавлением 4% параформальдегида (PFA, Alfa Aesar) и анализировали проточным цитометром с использованием CellStream (Luminex). Стробирование ячеек осуществлялось на основе прямого и бокового рассеяния.Интенсивность флуоресценции (FL) 10000 закрытых нейтрофилов измеряли для каждого образца, и фагоцитоз определяли, когда нейтрофилы выражали флуоресценцию. Среднее геометрическое значение интенсивности флуоресценции (GMFI) рассчитывали с использованием программного обеспечения CellStream.

Измерение цитокинов в цельной крови человека

Свежеотобранную цельную кровь человека, обработанную гирудином, инкубировали с WT и ΔCbpD, как описано в разделе «Анализ выживаемости бактерий в крови», в течение 1 и 3 часов. Образцы плазмы немедленно собирали центрифугированием (10 мин, 2000 × г ) при 4 ° C, хранили при -70 ° C.Профилирование цитокинов выполняли с использованием теста Bio-Plex Pro ^TM Human Cytokine 27-plex (Bio-Rad) в соответствии с инструкциями производителя.

Измерение продукта активации комплемента в цельной крови человека

Свежеотобранную цельную кровь человека, обработанную гирудином, инкубировали с WT и ΔCbpD в течение 30 минут при встряхивании, как описано в разделе «Анализ выживаемости бактерий в крови». Когда указано, к образцам добавляли rCbpD _PA в конечной концентрации 20 мкг / мл ^-1 .После инкубации образцы немедленно обрабатывали 1 мкМ EDTA и собирали плазму центрифугированием (10 мин, 2000 × г) при 4 ° C. Концентрации продуктов активации комплемента, C3bc и TCC, измеряли с помощью собственных анализов ELISA, как подробно описано ранее ¹²³ . Активацию последнего общего пути (отраженного в уровнях C3bc) количественно оценивали с использованием mAb bH6 (Siemens Healthcare), специфичного для неоэпитопа, экспонированного в C3b, iC3b и C3c, как описано ранее.Активацию комплекса терминального комплемента / атакующего мембраны (TCC / MAC) измеряли с использованием mAb aE11, специфичного для неоэпитопа на C9 ⁵⁹ . Уровень C5a в плазме определяли с помощью набора C5a ELISA от Hycult.

Иммуноблот-анализ CbpD

Ночную культуру бактерий в LB разбавляли 1: 100 и выращивали в LB с добавлением карбенициллина (300 мкг мл ^-1 ) и арабинозы (6,6 мМ) до фазы среднего экспоненциального роста. Для оценки высвобождения CbpD к бактериальной культуре немедленно добавляли 1 мМ PMSF и 1 × полные ингибиторы протеазы, не содержащие мини-EDTA, и супернатант собирали центрифугированием (4500 × g , 15 мин, 4 ° C).Супернатант культуры пропускали через фильтр 0,22 мкм для удаления оставшихся бактериальных остатков и концентрировали 20 раз с использованием центробежного фильтрующего устройства Amicon Ultra 10 K (Millipore). Присутствие CbpD оценивали иммуноблоттингом с использованием антитела, специфичного к CbpD. Аффинно очищенное антитело CbpD было создано Davids Biotechnologie путем иммунизации кроликов пептидами KDGYNPEKPLAWSDLEPA и DAQGRDAQRHSLTLAQGANGA. HRP-конъюгированные козьи антикроличьи IgG (Invitrogen, № по каталогу 65–6120, разведение 1: 5000) использовали в качестве вторичных антител.Блот без посевов представлен на дополнительном рисунке 16.

Измерение жизнеспособности клеток

Клетки THP-1 и HL-60 высевали в 96-луночные планшеты (Corning), содержащие RPMI и IMDM с добавлением FBS (см. «Бактериальные штаммы и клетки линий ») соответственно. Клетки не обрабатывали или обрабатывали rCbpD _PA в конечной концентрации 0,2, 20, 50 или 100 мкг / мл ^-1 . В различные моменты времени планшеты центрифугировали, собирали супернатанты клеточных культур и проверяли их жизнеспособность с использованием набора для определения цитотоксичности (Promega) в соответствии с рекомендациями производителя.

Конкуренция за связывание поверхностно-экспрессируемого рецептора

Для определения предполагаемого рецептора для CbpD в крови смесь нейтрофилов и PBMC (5 × 10 ⁶ клеток мл ^-1 ) инкубировали с 20 мкг мл ^-1. rCbpD _EC в течение 15 мин в RPMI / HSA на льду. Затем добавляли FITC-, PE- и APC-конъюгированные mAb, направленные против панели поверхностно-экспрессируемых рецепторов лейкоцитов, с последующей 30-минутной инкубацией на льду. Моноклональные антитела (mAb), конъюгированные с фикоэритрином (PE), направленные против CD114 (LMM741, кат.554538, разведение: 1:10), CD87 (VIM5, каталожный номер 555768, разведение 1: 3), CD54 (HA58, каталожный номер 555511, разведение 1: 7,5), CD58 (1C3, каталожный номер 555921, разведение 1 : 10), CD35 (E11, каталожный номер 559872, разведение 1: 6), CD47 (B6h22, каталожный номер 556046, разведение 1: 5), CD119 (GIR-208, каталожный номер 558934, разведение 1:15) , CD49b (12F1, № по каталогу 555669, разведение 1:15) и CD44 (515, № по каталогу 550989, разведение 1: 150) были приобретены в BD Biosciences. Меченые флуоресцеинизотиоцианатом (FITC) mAb, направленные против CD11a (HI111, кат.5553, разведение 1: 4), CD15 (MMA, каталожный номер 332778, разведение 1: 150), CD147 (HIM6, каталожный номер 555962, разведение: 1:10), CD18 (3G8, каталожный номер 347953, разведение 1 : 15), CD31 (WM54, каталожный номер 555445, разведение 1:10), CD46 (E4.3, каталожный номер 555949, разведение 1:15), CD9 (M-L13, каталожный номер 555371, разведение 1: 7.5) и CD66 (B1.1, номер по каталогу: 551479, 1:15) были приобретены у BD Biosciences. Меченные аллофикоцианином (APC) моноклональные антитела против CD13 (WM15, каталожный номер 557454, разведение 1: 4), CD14 (M5E2, каталожный номер 555399, разведение 1: 4), CD16 (3G8, каталожный номер.557710, разведение 1: 300), CD11b (ICRF44, каталожный номер 550019, разведение 1: 4), CD11c (B-ly6, каталожный номер 559877, разведение 1: 4), CD29 (MAR4, каталожный номер 559883, разведение 1:10), CD55 (IA10, каталожный номер 555696, разведение 1:15) и CD45 (HI30, каталожный номер 555485, разведение 1:75) были приобретены у BD Biosciences. Анти-CD120a-FITCI (16803.161, № по каталогу FAB225G, разведение 1: 4), CD120b-FITC (22235.311, № по каталогу FAB226F, разведение 1: 5), CD181-PE (42705.111, № по каталогу FAB330P, разведение 1: 10), CD182-PE (CXCR2, № по каталогу FAB331P, разведение 1: 6) и Siglec-9-APC (1, № по каталогу.FAB1139A, разведение 1:20) были получены от R&D Systems. Анти-CD63-PE (CLB-gran / 12, каталожный номер IM1914U, разведение 1:15), CD43-FITC (6D269, каталожный номер sc-70684 FITC, разведение 1:15), BLTR-FITC (202 / 7B1 , № по кат. MCA2108F, разведение 1: 7,5) и CD89 (Mip8a, № по кат. MCA1824PE, разведение 1: 7,5), CD32-PE (7,3, № по кат. NBP2-47830PE, разведение 1: 150), CD282-PE ( T2.5, номер по каталогу 12-9024-82, разведение 1:30), были приобретены у Beckman Coulter Immunotech, Santa Cruz, Abd-Serotec и Ebioscience, соответственно. CD10-APC (MEM-78, кат.CD1005, разведение: 1:10) были получены от Invitrogen. CD88-PE (S5 / 1, № по каталогу 344304, разведение 1:50) был приобретен у BioLegend. Конъюгированный с FITC формил-Nle-Leu-Phe-Nle-Tyr-Lys, сокращенно FITC-fMLP (каталожный номер F1314, разведение 1: 1000), был приобретен у Invitrogen. После отмывки флуоресценцию измеряли проточной цитометрией (FACSVerse, Becton Dickinson). Предоставляются данные, связанные с PMN.

Отложение комплемента на бактериях

Отложение комплемента оценивали, как описано ранее ⁵⁸ , с модификациями.Бактерии выращивали до середины логарифмической фазы (OD ₆₀₀ ~ 0,5–0,6) в LB, промывали RPMI / HSA для удаления секретируемых белков и суспендировали в RPMI / HSA до OD ₆₆₀ 1,0. Затем промытые бактерии разбавляли в 10 раз RPMI / HSA. Затем 50 мкл бактериальной суспензии инкубировали с 50 мкл разбавленного NHS, HI-NHS и обедненного C5 NHS (ΔC5) (при конечной концентрации 0, 10 и 30% (об. / Об.), Если не указано иное). Образцы (общий объем = 100 мкл) инкубировали при 37 ° C при постоянном встряхивании в течение 45 мин.RPMI / HSA использовали в качестве разбавителя / буфера для сыворотки или промывочного раствора. Чтобы измерить отложение C3b, C5b9 и Bb, бактерии инкубировали с мышиным анти-C3b (ранее описанным в ссылке ⁵⁸ , в доме Alexa Fluor 488-меченный, 3 мкг мл ^-1 или C5b9 (в доме Alexa fluor -488-меченный, aE11, 1 мкг мл ^-1 (оба были любезно предоставлены профессором Rooijakkers, Университетский медицинский центр Утрехта, Нидерланды) и мышиные моноклональные антитела против Bb человека (1 мкг мл ^-1 , Quidel) в 100 мкл RPMI / HSA в течение 45–60 мин при 4 ° C.При необходимости бактерии дополнительно инкубировали с козьим антимышиным IgG, конъюгированным с Alexa Fluor 488 (1 мкг мл ^-1 , Invitrogen). Бактерии промывали и анализировали проточным цитометром с использованием MACSQuant (Miltenyi biotech) или CellStream (Luminex), анализируя 10000 событий для каждого условия. Бактерии отбирали на основании их свойств прямого и бокового рассеяния, и определяли среднее геометрическое значение популяции бактерий. Данные анализировали в программе FlowJo или CellStream.

Анализ активности комплемента

Для оценки влияния rCbpD _PA на функциональную способность классического (CP) и альтернативного (AP) путей комплемента, белок в конечной концентрации 0, 10, 20, 50, 100 и 200 мкг мл ^-1 инкубировали с 90% (об. / об.) объединенным NHS в течение 5 мин при 37 ° C.C5-обедненный NHS (C5) и ингибитор C5 OmCI (20 мкг мл ^-1 ) были включены в качестве контролей. Функциональность классического (CP) и альтернативного (AP) путей активации комплемента оценивалась с помощью скрининга системы комплемента Wielisa ^® (SVAR Life Science) с использованием уровней C5b-9 в качестве считывания ¹²⁴ . ELISA и расчет% активности выполняли в соответствии с инструкциями производителя.

Иммунофлуоресцентная микроскопия

Иммунофлуоресцентная микроскопия была выполнена, как описано ранее ¹²⁵ , с изменениями.Бактерии получали, как описано выше в разделе «Анализ выживаемости бактерий в крови», и инкубировали с 10% (об. / Об.) NHS или HI-NHS в течение 45 минут при 4 ° C при встряхивании. Образцы дважды промывали PBS с добавлением 1% BSA (Sigma) (PBS / BSA). Затем бактерии фиксировали PBS / BSA, содержащим 4% параформальдегид (PFA, Alfa Aesar), в течение 20 минут при комнатной температуре. Бактерии промывали один раз PBS / BSA, блокировали PBS / BSA в течение 1 ч при комнатной температуре и инкубировали с мышиным анти-C5b-9 (1 мкг мл ^-1 , aE11, Santa Cruz) с последующей инкубацией с Alexa Fluor 488. -конъюгированные козьи антимышиные IgG (1 мкг мл ^-1 , Life Technologies) в течение 45 мин.Бактерии промывали один раз PBS / BSA, а затем сбалансированным солевым раствором Хэнкса (HBSS, Gibco). В конечном итоге осадок ресуспендировали в HBSS с добавлением липофильного красителя FM5-95 (Invitrogen, 10 мкг мл ^-1 ) для мечения бактериальных мембран. Меченые бактериальные клетки помещали на предметные стекла (покрытые тонким слоем агарозного геля) и закрывали покровными стеклами. Флуоресцентную микроскопию выполняли на Zeiss AxioObserver, оснащенном цифровой CMOS-камерой ORCA ‐ Flash5.0 V2 (Hamamatsu Photonics) и программным обеспечением ZEN Blue.Изображения были получены через фазово-контрастный объектив × 100 и проанализированы программой ImageJ / Fiji (v 2.1.0 / 1.53c).

Анализ целостности мембраны

Оценивали проницаемость внешней мембраны для WT, ΔCbpD и транскомплемментированного штамма при воздействии сыворотки крови человека, как описано ранее ⁴⁵ с модификациями. Ночную культуру бактерий разбавляли 1: 100 и выращивали в LB до фазы среднего экспоненциального роста. Бактерии промывали PBS и ресуспендировали до OD ₆₀₀ = 0.4 в RPMI / HSA. NHS или HI-NHS добавляли в конечной концентрации 10% (об. / Об.) К подмножеству бактериальных культур. Культуры встряхивали при 37 ° C в течение 1 ч, после чего клетки собирали центрифугированием (3000 × г, , RT, 5 мин) и ресуспендировали в 10 мМ Трис-буфере pH 8,0. Затем N -фенилнафтиламин (NPN) добавляли в конечной концентрации 40 мкМ в конечном объеме 200 мкл на образец в 96-луночные планшеты с плоским дном (Costar). Планшеты немедленно считывали в Synergy h2 Hybrid Reader (BioTek), используя длины волн возбуждения и излучения 250 нм и 420 нм, соответственно.

Анализ чувствительности к моющим средствам

Чувствительность WT и ΔCbpD к додецилсульфату натрия ( SDS ) оценивали, как описано ранее, с небольшими модификациями ⁴⁷ . Бактериальную культуру подвергали воздействию возрастающих концентраций SDS (0, 1, 2 и 5%, мас. / Об.), Инкубировали в течение 5 минут при 37 ° C, а затем считывали OD ₆₀₀ с использованием Varioskan ^TM . Многорежимный считыватель микропланшетов LUX (Thermo Scientific).

Выделение, очистка и анализ LPS

Ночную культуру WT и ΔCbpD разводили 1: 100 и выращивали в среде LB до фазы экспоненциального роста (OD ₆₀₀ : 0.8–0,9). Бактерии промывали PBS и осадок хранили при -80 ° C до экстракции LPS. ЛПС экстрагировали из промытых и упакованных клеток методом экстракции Вестфала и Яна (1965) ¹²⁶ . Вкратце, образцы суспендировали в воде и равном объеме предварительно нагретого 90% фенола (Sigma) с последующим перемешиванием реакционной смеси при 65 ° C в течение 40 минут ¹²⁷ . Затем образцы немедленно охлаждали до 10 ° C и центрифугировали (2968 × g , 45 мин, 10 ° C). Верхний насыщенный фенолом водный слой, содержащий LPS, осторожно отбирали пипеткой и подвергали интенсивному диализу против воды для удаления фенола.Образцы лиофилизировали, ультрацентрифугировали (120000 × г, , 4 часа, 10 ° C), и осажденный ЛПС подвергали дополнительной обработке нуклеазой бензоназой (EMD Millipore) и протеиназой K (Sigma) с последующим вторым циклом обработки. ультрацентрифугирования при (120,000 × g , 4 ч, 10 ° C). Осажденный ЛПС использовали для анализа состава моносахаридов и жирных кислот с помощью ГХ-МС (Agilent Technologies) в качестве производного ТМС метилгликозида или производного альдитолацетата. Анализ кето-дезокси-D- манно- -8-октановой кислоты (Kdo) проводили с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии с детектированием флуоресценции (RP-UPLC, Acquity, Waters) с использованием колонки BEH-C18 (Waters).Вкратце, известное количество ЛПС гидролизовали с использованием 2 M HOAc (80 ° C, 3 ч) с последующим удалением кислоты и меткой Kdo 4,5-метилендиокси-1,2-фенилендиамина дигидрохлоридом (DMB, Sigma) до UPLC анализ. Для анализа липида-A известное количество очищенного LPS гидролизовали с использованием 2% HOAc (100 ° C, 2 часа). Затем липид-A осаждали центрифугированием (5000 × г, , 5 мин), сушили лиофилизацией и растворяли в смеси хлороформ: метанол (об. / Об.) 3: 1, содержащей 1 мМ формиат аммония (Sigma). .Образцы анализировали с помощью масс-спектрометра LTQ-XL Ion-Trap (Thermo Scientific) в отрицательном режиме.

Просвечивающая электронная микроскопия (ТЕМ)

Ночные культуры WT и ΔCbpD в LB разводили 1: 100 и выращивали в LB до фазы среднего экспоненциального роста. Чтобы визуализировать влияние сыворотки на лизис бактерий, бактерии промывали PBS и суспендировали в RPMI-HSA с добавлением 10% (об. / Об.) NHS или HI-NHS в течение 1 часа. Затем осадки клеток промывали 0,1 М натрий-какодилатным буфером (Sigma) и ненадолго фиксировали в смеси 2% параформальдегида (Sigma) и 2.5% глутаральдегид (Sigma) в 0,1 М какодилате натрия. Образцы обрабатывали 1% тетроксидом осмия (OsO ₄ ; TAAB) перед ступенчатой ​​дегидратацией в возрастающих концентрациях этанола с последующей инкубацией в ацетоне. Затем образцы пропитывали оксидом пропилена, заливали с помощью набора смолы EMbed 812 (Electron Microscopy Sciences) и, наконец, полимеризовали 48 часов при 60 ° C. Ультратонкие срезы собирали на медных сетках и окрашивали 2% уранилацетатом и 0,5% цитратом свинца на автоматическом контрастирующем приборе Leica EM AC20 (Leica Microsystems).Наконец, сетки были отображены с помощью ТЕМ (микроскоп Philips CM10), оборудованного камерой 600 Вт (Gatan) (80–90 кВ).

Мышиная модель внутривенной инфекции и профили цитокинов / хемокинов в сыворотке.

Установленную модель псевдомональной системной инфекции использовали для идентификации разницы в вирулентности между WT и изогенным мутантом ΔCbpD. Мышей содержали в клетках с верхними фильтрами с доступом к кормовым гранулам и воде при контролируемой температуре окружающей среды (20–22 ° C) и относительной влажности (30–70%), при цикле 12 часов света / 12 часов темноты.Самок мышей CD1 в возрасте восьми недель (Charles River Laboratories) инфицировали внутривенно приблизительно 2 × 10 ⁷ КОЕ WT или ΔCbpD путем инъекции в хвостовую вену ( n = 10 для оценки смертности, n = 8 для патофизиологического исследования). анализ). Параллельно дополнительная группа мышей ( n = 4) была ложно инфицирована PBS и служила контролем. Наблюдаемая смертность регистрировалась дважды в день в течение 14 дней после заражения. Для оценки бактериальной нагрузки мышей умерщвляли через 4 часа после инфицирования, а затем гомогенизировали органы с использованием Mini BeadBeater (Biospec).Гомогенизированные образцы серийно разводили в PBS и помещали на агар Лурия-Бертани (LA) для подсчета КОЕ на грамм ткани (почки, селезенка и печень) или на миллилитр крови. Сыворотку, полученную от инфицированных и контрольных мышей (ложно инфицированных 1 × PBS), использовали для профилирования цитокинов с помощью анализа мышиного цитокина 23-plex Bio-Plex Pro ^TM (Bio-Rad) в соответствии с инструкциями производителя.

Мышиная модель инфекции легких

Ночные культуры WT и ΔCbpD повторно выращивали в LB до фазы раннего экспоненциального роста (OD ₆₀₀ = 0.40) при 37 ° С. Бактерии промывали PBS и осадок разбавляли PBS до конечной концентрации 5 × 10 ⁶ КОЕ / 30 мкл (объем посева). Мышей ( n = 10 / группа) анестезировали 100 мг ^-1 кетамина и 10 мг ^-1 ксилазина. После успокоения голосовые связки визуализировали с помощью операционного отоскопа (Welch Allyn), и 30 мкл бактерий было закапано в трахею во время вдоха с помощью наконечника пипетки с пластиковой загрузкой геля.Мышей помещали на подогреваемую площадку для выздоровления, наблюдали каждые 12 ч после заражения и, соответственно, регистрировали летальные исходы.

Гистопатологический анализ

Селезенка инфицированных или неинфицированных животных ( n = 8 для WT, n = 8 для ΔCbpD и n = 4 для контроля) вскрывали и фиксировали путем инкубации в 10%. параформальдегид (PFA) на 24 ч, после чего образцы помещали в 70% этанол (длительное хранение), пока ткани не были залиты парафином.Срезы селезенки депарафинизировали в соответствии со стандартными протоколами путем погружения в ксилол и регидратировали в градиенте этанол / вода с последующей промывкой деионизированной (ДИ) водой. Регидратированные срезы / слайды окрашивали гематоксилином и эозином и оценивали под микроскопом. Изображения были получены с помощью светового микроскопа Olympus BX43, установленного с камерой IDS UI3260CP-C-HQ 2,3 МП (IDS Imaging Development Systems GmbH), с использованием программного обеспечения для сканирования всего слайда MicroVisioneer (MicroVisioneer Freising).

Определение протеома селезенки мыши в ответ на инфекцию PA14 и ΔCbpD

Для характеристики органоспецифических ответов на инфекцию WT и ΔCbpD мышам вводили внутривенно, а селезенки собирали при инфицировании, как описано в «Модель внутривенной инфекции на мышах» . Неинфицированные мыши (которым вводили 1 × PBS) служили фиктивным контролем. Гомогенаты органов обрабатывали, как описано ранее ¹²⁸ с модификациями. Гомогенаты лизировали в 75 мМ NaCl (Sigma), 3% додецилсульфате натрия (SDS, Fisher), 1 мМ NaF (Sigma), 1 мМ бета-глицерофосфат (Sigma), 1 мМ ортованадат натрия (Sigma), 10 мМ натрия. пирофосфат (Sigma), 1 мМ PMSF, 1 × полные мини-ингибиторы протеазы, не содержащие EDTA, и 1 × PhosSTOP ^TM в 50 Tris-HCL (Sigma), pH 8.5. Затем нерастворимый дебрис осаждали центрифугированием в течение 20 минут при 4500 × g и супернатанты переносили в новые пробирки. Белки разделяли с помощью SDS-PAGE с 10% гелем Mini-PROTEAN и окрашивали кумасси бриллиантовым синим R250. Гель разрезали, после чего белки восстанавливали, алкилировали и расщепляли в геле, как описано ранее ¹¹⁸ . Остальной анализ (трипсинизация, ЖХ-МС / МС) выполняли, как описано в разделе «Анализ бактериального протеома».

Статистическая значимость (дополнительные данные 7) была определена с помощью теста t . Дисперсия оценивалась с помощью F-теста, чтобы убедиться, что использовались правильные статистические допущения. Для учета множественных сравнений была применена поправка Бенджамини – Хохберга с вероятностью ложного обнаружения 5%. Дифференциально распространенные белки были определены с использованием q значений ≤ 0,05 и кратности изменения ≥ 1,5 (log ₂ = 0,58) (дополнительные данные 8). Анализ главных компонентов (PCA) использовался для уменьшения размерности многомерных данных до двух основных компонентов, чтобы кластеры данных могли быть визуализированы графически.Для этого было реализовано вменение K -ближайших соседей (kNN) для заполнения пропущенных значений, когда это возможно. Если значения для всех реплик образца отсутствовали, значения заменялись минимальным обнаруженным значением для этой реплики. Для дальнейшего изучения штаммов и группировки белков была выполнена агломеративная иерархическая кластеризация, которая визуализировалась в виде полярной дендрограммы или тепловой карты с дендрограммами по осям x и y . Анализ обогащения (дополнительные данные 10 и 11) выполняли с использованием Metascape (стабильный выпуск 3.5, 1 марта 2019 г.) ¹²⁹ с минимальным перекрытием, пороговым значением P и минимальным обогащением, установленным на 3, 0,01 и 2 соответственно. STRING-db ¹³⁰ использовался через приложение String для Cytoscape (версия 3.7.1) для визуализации связей между значительно изменяющимися белками, специфичными для селезенки. Соединения были ограничены доверительной вероятностью по умолчанию 0,4, а взаимодействия ограничивались только запросом. MATLAB R2018b использовался для всех графиков и анализов, если не указано иное.

Белки, которые однозначно и дифференцированно регулировались специфическим для WT / ΔCbpD образом (WT: 10; ΔCbpD: 128; дополнительные данные 10), были импортированы в Ingenuity Pathway Analysis (IPA) для анализа ядра (Ingenuity Systems). IPA (QIAGEN Inc.) использует алгоритмы прогнозирования восходящего регуляторного анализа (URA), последующего анализа эффектов (DEA), механистических сетей (MN) и анализа причинно-следственных сетей (CNA) для назначения функциональных аннотаций белкам и выполнения анализа регуляторных сетей ^{131 132} .Программное обеспечение IPA использовалось для выполнения анализа канонических путей для определения существенно затронутых путей и измерения их перекрытия на основе общих молекул. Сетевой анализ взаимодействия IPA использовался для построения сетей, идентифицирующих регуляторные события, связывающие молекулярные сигнальные сигнатуры с транскрипционными эффектами.

Декларации этики

Мышей использовали для проведения псевдомонадных системных и интратрахеальных инфекций. Эти эксперименты соответствовали всем этическим нормам для исследований на животных и проводились в соответствии с утвержденным протоколом IRB S00227M Калифорнийского университета в Сан-Диего в соответствии с правилами и положениями Институционального комитета по уходу и использованию животных.Кровь была взята у нескольких здоровых добровольцев (мужчин и женщин) в соответствии с этическими принципами Хельсинкской декларации и протоколами, утвержденными Комитетом по медицинской этике UMC и REK-Norway (2018/1586). Все доноры крови дали письменное информированное согласие.

Статистический анализ

Все данные, за исключением протеомики, компьютерного моделирования и ферментативной активности, были проанализированы и нанесены на график с помощью GraphPad Prism 8.0. Данные представлены как среднее значение ± стандартная ошибка среднего (SEM), если иное не указано на рисунке или в дополнительных пояснениях к данным.Тест T , двухфакторный дисперсионный анализ или логранговый тест (выживаемость in vivo) в программном пакете GraphPad Prism (версия 8.3) использовались для определения статистической значимости ( P <0,05). Статистический анализ, связанный с протеомными данными или компьютерным моделированием, подробно описан в соответствующих подразделах.

Краткое изложение отчета

Дополнительная информация о дизайне исследования доступна в Резюме отчета по исследованию природы, связанном с этой статьей.

Взгляд кристаллографа на новый класс ферментов, разлагающих биомассу

Ссылки

Aachmann, F.Л., Сорли, М., Скьяк-Брак, Г., Эйсинк, В. Г. Х. и Ваайе-Колстад, Г. (2012). Proc. Natl Acad. Sci. США , 109 , 18779–18784. CrossRef CAS PubMed Google Scholar
Agger, JW, Isaksen, T., Várnai, A., Vidal-Melgosa, S., Willats, WG, Ludwig, R., Horn, SJ, Eijsink, VGH & Westereng, B. (2014 г.) ). Proc. Natl Acad. Sci. США , 111 , 6287–6292. CrossRef CAS PubMed Google Scholar
Bacik, J.-P., Mekasha, S., Forsberg, Z., Kovalevsky, A., Nix, J. C., Cuneo, M. J., Coates, L., Vaaje-Kolstad, G., Chen, J. C.-H., Eijsink, V. G. H., Unkefer, C. J. (2015). Acta Cryst. F 71 , 1448–1452. CrossRef IUCr Journals Google Scholar
Bayer, E. A., Lamed, R. & Himmel, M. E. (2007). Curr. Opin. Biotechnol. 18 , 237–245. CrossRef PubMed CAS Google Scholar
Бисон, У. Т., Филлипс, К. М., Кейт, Дж. Х. и Марлетта, М. А. (2012). J. Am. Chem. Soc. 134 , 890–892.Web of Science CrossRef CAS PubMed Google Scholar
Beeson, W. T., Vu, V. V., Span, E. A., Phillips, C. M. & Marletta, M. A. (2015). Annu. Rev. Biochem. 84 , 923–946. CrossRef CAS PubMed Google Scholar
Béguin, P. (1990). Annu. Rev. Microbiol. 44 , 219–248. PubMed Web of Science Google Scholar
Bennati-Granier, C., Garajova, S., Champion, C., Grisel, S., Haon, M., Zhou, S., Fanuel, M., Ropartz, D., Rogniaux , Х., Гимберт, И., Record, E. & Berrin, J.-G. (2015). Biotechnol. Biofuels , 8 , 90. PubMed Google Scholar
Blake, C. C. F., Koenig, D. F., Mair, G. A., North, A. C. T., Phillips, D. C. & Sarma, V. R. (1965). Nature (Лондон) , 206 , 757–761. CrossRef CAS PubMed Web of Science Google Scholar
Book, А. Дж., Йеннамали, Р. М., Такасука, Т. Е., Карри, К. Р., Филлипс, Г. Н. и Фокс, Б. Г. (2014). Biotechnol. Биотопливо , 7 , 109.Google Scholar
Boraston, A. B., Bolam, D. N., Gilbert, H. J. & Davies, G. J. (2004). Biochem. J. 382 , 769–781. CrossRef PubMed CAS Google Scholar
Borisova, A. S., Isaksen, T., Dimarogona, M., Kognole, A. A., Mathiesen, G., Várnai, A., Røhr, Å. К., Пейн, К. М., Сорли, М., Сандгрен, М. и Эйсинк, В. Г. Х. (2015). J. Biol. Chem. 290 , 22955–22969. CrossRef CAS PubMed Google Scholar
Bornscheuer, U., Buchholz, K.И Сейбел Дж. (2014). Angew. Chem. Int. Эд. 53 , 10876–10893. CrossRef CAS Google Scholar
Brown, K., Harris, P., Zaretsky, E., Re, E., Vlasenko, E., Mcfarland, K. & Lopez, D. L.A. (2006). Патент WO2005074647. Google Scholar
Буск, П. К. и Ланге, Л. (2015). BMC Genomics , 16 , 368. Google Scholar
Каннелла, Д., Мёллерс, К. Б., Фригаард, Н. У., Йенсен, П. Э., Бьеррум, М. Дж., Йохансен, К. С. и Фелби, К. (2016). Nat. Commun. 7 , 11134. CrossRef PubMed Google Scholar
Карпита, Н. К. и Гибо, Д. М. (1993). Plant J. 3 , 1–30. CrossRef CAS PubMed Google Scholar
Чаплин, А. К., Уилсон, М. Т., Хаф, М. А., Свистуненко, Д. А., Хемсворт, Г. Р., Уолтон, П. Х., Виджгенбум, Э. и Уорролл, Дж. А. Р. (2016). J. Biol. Chem. 291 , 12838–12850. CrossRef CAS PubMed Google Scholar
Chen, P. & Solomon, E. I.(2004). J. Am. Chem. Soc. 126 , 4991–5000. CrossRef PubMed CAS Google Scholar
Chiu, E., Hijnen, M., Bunker, RD, Boudes, M., Rajendran, C., Aizel, K., Oliéric, V., Schulze-Briese, C., Mitsuhashi, W ., Янг В., Уорд В.К., Бергойн М., Меткалф П. и Кулибали Ф. (2015). Proc. Natl Acad. Sci. США , 112 , 3973–3978. Web of Science CrossRef CAS PubMed Google Scholar
Courtade, G., Wimmer, R., Røhr, A.K., Preims, M., Felice, A.К. Г., Димарогона, М., Ваайе-Колстад, Г., Сорли, М., Сандгрен, М., Людвиг, Р., Эйсинк, В. Г. Х. и Аахманн, Ф. Л. (2016). Proc. Natl Acad. Sci. USA , 113 , 5922–5927. CrossRef CAS PubMed Google Scholar
Cragg, SM, Beckham, GT, Bruce, NC, Bugg, TDH, Distel, DL, Dupree, P., Etxabe, AG, Goodell, BS, Jellison, J., McGeehan, JE, McQueen- Мейсон, С.Дж., Шнорр, К., Уолтон, PH, Уоттс, JEM и Циммер, М. (2015). Curr. Opin.Chem. Биол. 29 , 108–119. CrossRef CAS PubMed Google Scholar
Крайтон Р. Р. (2012). Биологическая неорганическая химия: новое введение в структуру и функции молекул , 2-е изд. Амстердам: Эльзевир. Google Scholar
Крауч, Л. И., Лабурель, А., Уолтон, П. Х., Дэвис, Г. Дж. И Гилберт, Х. Дж. (2016). J. Biol. Chem. 291 , 7439–7449. CrossRef CAS PubMed Google Scholar
Davies, G.J., Mackenzie, L., Varrot, A., Dauter, M., Бжозовский, А. М., Шюлейн, М., Уизерс, С. Г. (1998). Биохимия , 37 , 11707–11713. Web of Science CrossRef CAS PubMed Google Scholar
Дэвис, Дж. Дж., Уилсон, К. С. и Хенриссат, Б. (1997). Biochem. J. 321 , 557–559. CrossRef CAS PubMed Web of Science Google Scholar
Dhar, D. & Tolman, W. B. (2015). J. Am. Chem. Soc. 137 , 1322–1329. CSD CrossRef CAS PubMed Google Scholar
Димарогона, М., Топакас, Э., Олссон, Л. и Кристакопулос, П. (2012). Биоресурсы. Technol. 110 , 480–487. CrossRef CAS PubMed Google Scholar
Доан, Н. и Геттинс, П. У. (2007). Biochem. J. 407 , 23–30. CrossRef PubMed CAS Google Scholar
Донохью, П. Дж., Тегеранчи, Дж., Крамер, К. Дж., Саранги, Р., Соломон, Э. И. и Толман, В. Б. (2011). J. Am. Chem. Soc. 133 , 17602–17605. CSD CrossRef CAS PubMed Google Scholar
Eibinger, M., Ганнер, Т., Бубнер, П., Рошкер, С., Крахер, Д., Халтрих, Д., Людвиг, Р., Планк, Х. и Нидецки, Б. (2014). J. Biol. Chem. 289 , 35929–35938. CrossRef CAS PubMed Google Scholar
Eriksson, K.-E., Pettersson, B. & Westermark, U. (1974). FEBS Lett. 49 , 282–285. CrossRef CAS PubMed Google Scholar
Fleming, A. (1922). Proc. R. Soc. В: Биол. Sci. 93 , 306–317. Google Scholar
Floudas, D. et al. (2012). Science , 336 , 1715–1719. Web of Science CrossRef CAS PubMed Google Scholar
Floudas, D. et al. (2015). Fungal Genet. Биол. 76 , 78–92. CrossRef CAS PubMed Google Scholar
Forsberg, Z., Mackenzie, A. K., Sørlie, M., Røhr, Å. К., Хелланд, Р., Арваи, А. С., Ваайе-Колстад, Г. и Эйсинк, В. Г. Х. (2014). Proc. Natl Acad. Sci. США , 111 , 8446–8451. CrossRef CAS PubMed Google Scholar
Forsberg, Z., Нельсон, К. Э., Далхус, Б., Мекаша, С., Луз, Дж. С. М., Крауч, Л. И., Рёр, А. К., Гарднер, Дж. Г., Эйсинк, В. Г. Х. и Ваайе-Колстад, Г. (2016). J. Biol. Chem. 291 , 7300–7312. CrossRef CAS PubMed Google Scholar
Forsberg, Z., Røhr, Å. К., Мекаша, С., Андерссон, К. К., Эйсинк, В. Г. Х., Ваайе-Колстад, Г. и Сорли, М. (2014). Биохимия , 53 , 1647–1656. CrossRef CAS PubMed Google Scholar
Forsberg, Z., Vaaje-Kolstad, G., Вестеренг, Б., Бунаес, А.С., Стенстрём, Ю., МакКензи, А., Сорли, М., Хорн, С. Дж. И Эйсинк, В. Г. Х. (2011). Protein Sci. 20 , 1479–1483. Web of Science CrossRef CAS PubMed Google Scholar
Frandsen, K. E. et al. (2016). Nat. Chem. Биол. 12 , 298–303. CrossRef CAS PubMed Google Scholar
Frederiksen, R.F., Paspaliari, D.K., Larsen, T., Storgaard, B.G., Larsen, M.H., Ingmer, H., Palcic, M.M. & Leisner, J.J. (2013). Микробиология , 159 , 833–847. CrossRef CAS PubMed Google Scholar
Frommhagen, M., Sforza, S., Westphal, A.H., Visser, J., Hinz, S.WA., Koetsier, M.J., van Berkel, W.J.H., Gruppen, H. & Kabel, M.A. (2015). Biotechnol. Биотопливо , 8 , 101. CrossRef PubMed Google Scholar
Fuchs, R. L., McPherson, S. A. & Drahos, D. J. (1986). Заявл. Environ. Microbiol. 51 , 504–509. PubMed CAS Google Scholar
Gagnon, N.И Толман, В. Б. (2015). В соотв. Chem. Res. 48 , 2126–2131. CrossRef CAS PubMed Google Scholar
Garajova, S., Mathieu, Y., Beccia, MR, Bennati-Granier, C., Biaso, F., Fanuel, M., Ropartz, D., Guigliarelli, B., Record, E ., Rogniaux, H., Henrissat, B. & Berrin, J.-G. (2016). Sci. Rep. 6 , 28276. CrossRef PubMed Google Scholar
Гибсон Д. М., Кинг Б. К., Хейс М. Л. и Бергстром Г. К. (2011). Curr. Opin. Microbiol. 14 , 264–270. CrossRef CAS PubMed Google Scholar
Glass, N. L., Schmoll, M., Cate, J. H. D. & Coradetti, S. (2013). Annu. Rev. Microbiol. 67 , 477–498. CrossRef CAS PubMed Google Scholar
Грегори Р. К., Хемсворт Г. Р., Тюркенбург Дж. П., Харт С. Дж., Уолтон П. Х. и Дэвис Г. Дж. (2016). Dalton Trans. DOI: 10.1039 / c6dt02793h. Google Scholar
Gudmundsson, M., Kim, S., Wu, M., Ishida, T., Momeni, M.H., Vaaje-Kolstad, G., Лундберг, Д., Роян, А., Стальберг, Дж., Эйсинк, В. Г. Х., Бекхэм, Г. Т., Сандгрен, М. (2014). J. Biol. Chem. 289 , 18782–18792. CrossRef CAS PubMed Google Scholar
Guerriero, G., Hausman, J. F., Strauss, J., Ertan, H. & Siddiqui, K. S. (2016). Eng. Life Sci. 16 , 1–16. CrossRef CAS Google Scholar
Harris, P. V., Welner, D., McFarland, K. C., Re, E., Navarro Poulsen, J. C., Brown, K., Salbo, R., Ding, H., Vlasenko, E., Мерино, С., Сюй, Ф., Черри, Дж., Ларсен, С., Ло Леджо, Л. (2010). Биохимия , 49 , 3305–3316. Web of Science CrossRef CAS PubMed Google Scholar
Harris, P. V., Xu, F., Kreel, N. E., Kang, C. & Fukuyama, S. (2014). Curr. Opin. Chem. Биол. 19 , 162–170. Web of Science CrossRef CAS PubMed Google Scholar
Hayes, M., Carney, B., Slater, J. & Brück, W. (2008). Biotechnol. J. 3 , 878–889. CrossRef PubMed CAS Google Scholar
Hellemond, E.В. ван, Леферинк, Н. Г. Х., Хейтс, Д., Фраайе, М. В. и ван Беркель, В. Дж. Х. (2006). Adv. Прил. Microbiol. , 60 , 17–54. PubMed Google Scholar
Хемсворт, Г. Р., Дэвис, Г. Дж. И Уолтон, П. Х. (2013). Curr. Opin. Struct. Биол. 23 , 660–668. Web of Science CrossRef CAS PubMed Google Scholar
Хемсворт, Г. Р., Хенриссат, Б., Дэвис, Г. Дж. И Уолтон, П. Х. (2014). Nat. Chem. Биол. 10 , 122–126. CrossRef CAS PubMed Google Scholar
Hemsworth, G.Р., Джонстон, Э. М., Дэвис, Дж. Дж. И Уолтон, П. Х. (2015). Trends Biotechnol. 33 , 747–761. CrossRef CAS PubMed Google Scholar
Хемсворт, Г. Р., Тейлор, Э. Дж., Ким, Р. К., Грегори, Р. К., Льюис, С. Дж., Тюркенбург, Дж. П., Паркин, А., Дэвис, Г. Дж. И Уолтон, П. Х. (2013). J. Am. Chem. Soc. 135 , 6069–6077. Web of Science CrossRef CAS PubMed Google Scholar
Henrissat, B. (1991). Biochem. J. 280 , 309–316.CrossRef PubMed CAS Web of Science Google Scholar
Henrissat, B., Claeyssens, M., Tomme, P., Lemesle, L. & Mornon, J.-P. (1989). Ген , 81 , 83–95. CrossRef CAS PubMed Google Scholar
Henrissat, B. & Davies, G. (1997). Curr. Opin. Struct. Биол. 7 , 637–644. CrossRef CAS PubMed Web of Science Google Scholar
Holm, L., Kääriäinen, S., Rosenström, P. & Schenkel, A. (2008). Биоинформатика , 24 , 2780–2781.Web of Science CrossRef PubMed CAS Google Scholar
Horn, S. J., Vaaje-Kolstad, G., Westereng, B. & Eijsink, V.G.H. (2012). Biotechnol. Биотопливо , 5 , 45. Web of Science CrossRef PubMed Google Scholar
Isaksen, T., Westereng, B., Aachmann, FL, Agger, JW, Kracher, D., Kittl, R., Ludwig, R., Халтрич, Д., Эйсинк, В.Г.Х. и Хорн, С.Дж. (2014). J. Biol. Chem. 289 , 2632–2642. Web of Science CrossRef CAS PubMed Google Scholar
Itoh, S.(2006). Curr. Opin. Chem. Биол. 10 , 115–122. CrossRef PubMed CAS Google Scholar
Itzstein, M. von & Thomson, R. (2009). Антивирусные стратегии , под редакцией Х.-Г. Краусслих и Р. Бартеншлагер, стр. 111–154. Берлин, Гейдельберг: Springer-Verlag. Google Scholar
Johansen, K. S. (2016 a ). Biochem. Soc. Пер. 44 , 143–149. CrossRef CAS PubMed Google Scholar
Johansen, K. S. (2016 b ). Trends Plant Sci. , DOI: 10.1016 / j.tplants.2016.07.012. Google Scholar
Kamachi, T., Kihara, N., Shiota, Y. & Yoshizawa, K. (2005). Inorg. Chem. 44 , 4226–4236. CrossRef PubMed CAS Google Scholar
Karkehabadi, S., Hansson, H., Kim, S., Piens, K., Mitchinson, C. & Sandgren, M. (2008). J. Mol. Биол. 383 , 144–154. CrossRef PubMed CAS Google Scholar
Karlsson, J., Saloheimo, M., Siika-Aho, M., Tenkanen, M., Пенттила, М. и Тьернелд, Ф. (2001). Eur. J. Biochem. 268 , 6498–6507. CrossRef PubMed CAS Google Scholar
Ким, С., Стольберг, Дж., Сандгрен, М., Патон, Р. С. и Бекхэм, Г. Т. (2014). Proc. Natl Acad. Sci. США , 111 , 149–154. Web of Science CrossRef CAS PubMed Google Scholar
Ким И. Дж., Юн Х. Дж. И Ким К. Х. (2016). Process Biochem. , DOI: 10.1016 / j.procbio.2016.06.017. Google Scholar
Kjaergaard, C.H., Qayyum, MF, Wong, SD, Xu, F., Hemsworth, GR, Walton, DJ, Young, NA, Davies, GJ, Walton, PH, Johansen, KS, Hodgson, KO, Hedman, B. & Solomon , EI (2014). Proc. Natl Acad. Sci. США , 111 , 8797–8802. Web of Science CrossRef CAS PubMed Google Scholar
Klinman, J. P. (2006). J. Biol. Chem. 281 , 3013–3016. Web of Science CrossRef PubMed CAS Google Scholar
Kohler, A. et al. (2015). Nat.Genet. 47 , 410–415. CrossRef CAS PubMed Google Scholar
Kracher, D., Scheiblbrandner, S., Felice, AKG, Breslmayr, E., Preims, M., Ludwicka, K., Haltrich, D., Eijsink, VGH & Ludwig, R. (2016 ). Science , 352 , 1098–1101. CrossRef CAS PubMed Google Scholar
Ланге, Л., Хуанг, Ю. Х. и Буск, П. К. (2016). Заявл. Microbiol. Biotechnol. 100 , 2083–2096. CrossRef CAS PubMed Google Scholar
Langston, J.А., Шагаси, Т., Аббат, Э., Сюй, Ф., Власенко, Э., Суини, М. Д. (2011). Заявл. Environ. Microbiol. 77 , 7007–7015. CrossRef CAS PubMed Google Scholar
Levasseur, A., Drula, E., Lombard, V., Coutinho, P. M. & Henrissat, B. (2013). Biotechnol. Биотопливо , 6 , 41. CrossRef PubMed Google Scholar
Li, X., Beeson, W. T. IV, Phillips, C. M., Marletta, M. A. & Cate, J. H. D. (2012). Строение , 20 , 1051–1061.CrossRef PubMed Google Scholar
Lo Leggio, L. et al. (2015). Nat. Commun. 6 , 5961. CrossRef PubMed Google Scholar
Lo Leggio, L., Welner, D. & De Maria, L. (2012). Comput. Struct. Biotechnol. J. 2 , e201209019. PubMed Google Scholar
Lombard, V., Golaconda Ramulu, H., Drula, E., Coutinho, P. M. & Henrissat, B. (2014). Nucleic Acids Res. 42 , D490 – D495. Web of Science CrossRef CAS PubMed Google Scholar
Loose, J.С. М., Форсберг, З., Фраайе, М. В., Эйсинк, В. Г. Х. и Ваайе-Колстад, Г. (2014). FEBS Lett. 588 , 3435–3440. CrossRef CAS PubMed Google Scholar
Mekasha, S., Forsberg, Z., Dalhus, B., Bacik, J.-P., Choudhary, S., Schmidt-Dannert, C., Vaaje-Kolstad, G. & Eijsink, VGH (2016). FEBS Lett. 590 , 34–42. CrossRef CAS PubMed Google Scholar
Паспалиари, Д. К., Луз, Дж. С. М., Ларсен, М. Х. и Ваайе-Колстад, Г. (2015). FEBS J. 282 , 921–936. CrossRef CAS PubMed Google Scholar
Pérez, S. & Bertoft, E. (2010). Крахмал , 62 , 389–420. Google Scholar
Филлипс, К. М., Бисон, В. Т., Кейт, Дж. Х. и Марлетта, М. А. (2011). ACS Chem. Биол. 6 , 1399–1406. Web of Science CrossRef CAS PubMed Google Scholar
Поллегиони, Л., Тонин, Ф. и Розини, Э. (2015). FEBS J. 282 , 1190–1213. CrossRef CAS PubMed Google Scholar
Quinlan, R.J. et al. (2011). Proc. Natl Acad. Sci. USA , 108 , 15079–15084. Web of Science CrossRef CAS PubMed Google Scholar
Rytioja, J., Hildén, K., Yuzon, J., Hatakka, A., de Vries, R.P., Mäkelä, M.R. (2014). Microbiol. Мол. Биол. Ред. 78 , 614–649. CrossRef PubMed Google Scholar
Shah, F. et al. (2016). New Phytol. 209 , 1705–1719. CrossRef CAS PubMed Google Scholar
Shepard, E.М. и Дули, Д. М. (2015). В соотв. Chem. Res. 48 , 1218–1226. CrossRef CAS PubMed Google Scholar
Smith, S. M., Rawat, S., Telser, J., Hoffman, B.M., Stemmler, T. L. & Rosenzweig, A.C. (2011). Биохимия , 50 , 10231–10240. CrossRef CAS PubMed Google Scholar
Solomon, E. I., Chen, P., Metz, M., Lee, S. K. & Palmer, A. E. (2001). Angew. Chem. Int. Эд. 40 , 4570–4590. CrossRef CAS Google Scholar
Соломон, Э.И., Хеппнер, Д. Э., Джонстон, Э. М., Гинсбах, Дж. У., Чирера, Дж., Кайюм, М., Кибер-Эммонс, М. Т., Кьяргард, К. Х., Хадт, Р. Г., Тиан, Л. (2014). Chem. Ред. 114 , 3659–3853. Web of Science CrossRef CAS PubMed Google Scholar
Span, E. A. & Marletta, M. A. (2015). Curr. Opin. Struct. Биол. 35 , 93–99. CrossRef CAS PubMed Google Scholar
Stellato, F. et al. (2014). IUCrJ , 1 , 204–212.Web of Science CrossRef CAS PubMed IUCr Journals Google Scholar
Suzuki, K., Suzuki, M., Taiyoji, M., Nikaidou, N. & Watanabe, T. (1998). Biosci. Biotechnol. Биохим. 62 , 128–135. CrossRef CAS PubMed Google Scholar
Tan, TC, Kracher, D., Gandini, R., Sygmund, C., Kittl, R., Haltrich, D., Hällberg, BM, Ludwig, R. & Divne, C. (2015 ). Nat. Commun. 6 , 7542. CrossRef PubMed Google Scholar
Terwilliger, T. C., DiMaio, F., Рид, Р. Дж., Бейкер, Д., Бункоци, Г., Адамс, П. Д., Гросс-Кунстлеве, Р. В., Афонин, П. В. и Эчолс, Н. (2012). J. Struct. Функц. Геномика , 13 , 81–90. CrossRef CAS PubMed Google Scholar
Ваайе-Колстад, Г., Бёле, Л. А., Госейднес, С., Далхус, Б., Бьёрас, М., Матизен, Г. и Эйсинк, В. Г. Х. (2012). J. Mol. Биол. 416 , 239–254. CAS PubMed Google Scholar
Vaaje-Kolstad, G., Horn, S.J., Sørlie, M. & Eijsink, V.G.H.(2013). FEBS J. 280 , 3028–3049. CAS PubMed Google Scholar
Vaaje-Kolstad, G., Horn, S.J., van Aalten, D.M.F., Synstad, B. & Eijsink, V.G.H. (2005). J. Biol. Chem. 280 , 28492–28497. Web of Science PubMed CAS Google Scholar
Ваайе-Колстад, Г., Хьюстон, Д. Р., Римен, А. Х. К., Эйсинк, В. Г. Х. и ван Аалтен, Д. М. Ф. (2005). J. Biol. Chem. 280 , 11313–11319. PubMed CAS Google Scholar
Vaaje-Kolstad, G., Вестеренг, Б., Хорн, С. Дж., Лю, З., Чжай, Х., Сорли, М., Эйсинк, В. Г. Х. (2010). Science , 330 , 219–222. Web of Science CAS PubMed Google Scholar
Vu, V. V., Beeson, W. T., Phillips, C. M., Cate, J. H. D. & Marletta, M. A. (2014). J. Am. Chem. Soc. 136 , 562–565. CrossRef CAS PubMed Google Scholar
Vu, V. V., Beeson, W. T., Span, E. A., Farquhar, E. R. & Marletta, M. A. (2014). Proc. Natl Acad. Sci. США , 111 , 13822–13827.CrossRef CAS PubMed Google Scholar
Vu, V. V. & Marletta, M. A. (2016). Cell. Мол. Life Sci. 73 , 2809–2919. CrossRef CAS PubMed Google Scholar
Уолтон, П. Х. и Дэвис, Г. Дж. (2016). Curr. Opin. Chem. Биол. 31 , 195–207. CrossRef CAS PubMed Google Scholar
Wei, N., Quarterman, J. & Jin, Y.-S. (2013). Trends Biotechnol. 31 , 70–77. CrossRef CAS PubMed Google Scholar
Welner, D.Х., Дженсен, М. Х., МакФарланд, К. К., Поульсен, Ж.-К. Н., Оттен, Х., Салбо, Р., Кристенсен, У., Харрис, П. В., Ларсен, С., Борхерт, Т. (2009). В Биотехнология деградации лигноцеллюлозы и использования биомассы — Mie Bioforum 2008. Tokyo: Ito Print Publishing Division. Google Scholar
Westereng, B., Cannella, D., Agger, J. W., Jørgensen, H., Andersen, M. L., Eijsink, V. G. H., Felby, C. (2015). Sci. Rep. 5 , 18561. CrossRef PubMed Google Scholar
Westereng, B., Исида, Т., Ваадже-Колстад, Г., Ву, М., Эйсинк, В. Г. Х., Игараши, К., Самедзима, М., Стольберг, Дж., Хорн, С. Дж. И Сандгрен, М. (2011). PLoS One , 6 , e27807. CrossRef PubMed Google Scholar
Wong, E., Vaaje-Kolstad, G., Ghosh, A., Hurtado-Guerrero, R., Konarev, PV, Ibrahim, AFM, Svergun, DI, Eijsink, VGH, Chatterjee, NS & van Аалтен, DMF (2012). PLoS Pathog. 8 , e1002373. CrossRef PubMed Google Scholar
Wu, M., Бекхэм, Г.Т., Ларссон, А.М., Исида, Т., Ким, С., Пейн, С.М., Химмель, М.Э., Кроули, М.Ф., Хорн, С.Дж., Вестеренг, Б., Игараси, К., Самедзима, М., Стольберг, Дж., Эйсинк, В.Г.Х. и Сандгрен, М. (2013). J. Biol. Chem. 288 , 12828–12839. CrossRef CAS PubMed Google Scholar
Яковлев, И., Ваайе-Колстад, Г., Хиетала, А. М., Стефаньчик, Э., Сольхейм, Х. и Фоссдал, К. Г. (2012). Заявл. Microbiol. Biotechnol. 95 , 979–990. CrossRef CAS PubMed Google Scholar
Yoder, M.Д., Кин, Н. Т. и Юрнак, Ф. (1993). Science , 260 , 1503–1507. CrossRef CAS PubMed Web of Science Google Scholar
Yoshizawa, K., Kihara, N., Kamachi, T. & Shiota, Y. (2006). Inorg. Chem. 45 , 3034–3041. CrossRef PubMed CAS Google Scholar
Zeng, Y., Zhao, S., Yang, S. & Ding, S.-Y. (2014). Curr. Opin. Biotechnol. 27 , 38–45. CrossRef CAS PubMed Google Scholar
Zhang, L., Koay, M., Maher, M.Дж., Сяо, З. и Уэдд, А. Г. (2006).