9044

1. Блог вирусологии: Обнаружение вирусов: анализ зубного налета
2. Биология микроорганизмов Брока, Майкл Т.Мэдиган
3. Принципы микробиологии Рональда М. Атласа
4. Лабораторные упражнения по микробиологии Роберта А. Поллака и др.

Связанные

Лаборатория 1: Фаговое титрование

Фаговое титрование (определение количества фагов).
частиц в запасе) — важный метод молекулярной биологии. Когда проверяются генетические библиотеки в фаговых векторах
для положительных клонов скрининговые планшеты должны иметь
приблизительно 50-500 фаговых бляшек на пластину для достижения оптимальных результатов.Меньше бляшек будет означать, что слишком много тарелок
придется проверить, в то время как большее количество бляшек затруднит идентификацию
отдельные положительные бляшки. Таблички в
идеальный диапазон получается путем подготовки последовательных разведений исходных фагов.

Также будет подготовлена ​​планшет для штриховок для одиночных колоний.

Несколько заметок о бактериофаге:

Бактериофаги составляют вирусов . Это означает, что для размножения им нужна подходящая клетка-хозяин.Фаговый запас, который вы будете титровать
содержит вектор клонирования бактериофага лямбда Ch5 с P. ochraceus Eco RI
в него клонирована геномная библиотека. Гостья
клеткой, используемой для выращивания фага, будет Escherichia coli штамм C600. Поскольку сайт связывания фага лямбда
белок транспорта мальтозы, клеток E. coli , используемых в качестве хозяина для лямбда
необходимо выращивать в среде, содержащей мальтозу, чтобы вызвать экспрессию lamB
ген.

Пластинчатые культуры бактериофагов получают путем комбинирования
фаг с восприимчивыми клетками-хозяевами в верхних слоях агара (поверх
чашки с обычным питательным агаром). Верхний агар
препараты содержат более низкие концентрации агара (7 г / л), чем обычные растворы
используется для приготовления чашек с агаром (15 г / л).
Низкая концентрация агара позволяет фагу-потомству из лизированных клеток
диффундируют через среду и заражают соседние бактериальные клетки. Когда эти клетки также лизируются, бляшка
(зона лизированных клеток) производится на планшете.Поскольку фаг может воспроизводиться только в активно растущих клетках,
размер образовавшихся бляшек будет зависеть от того, как скоро бактерии в агаре
достичь стационарной фазы и прекратить размножение.
На этом этапе бляшки перестанут распространяться.

Верхние слои агара получают путем смешивания разведенных фагов.
с чувствительными бактериями, а затем добавление ~ 3 мл жидкого верхового агара при 45-50 ° C. Накладки аккуратно перемешиваются, а затем заливаются
поверх предварительно нагретых пластин с питательным агаром.(Верхний агар должен поддерживаться при температуре 45-50 ° C до непосредственного
использование более высоких температур убьет бактерии, а более низкие температуры позволят
агар преждевременно затвердевает.)

зарядка:

Частицы бактериофага иногда прилипают к пластику или
стекло. Если частицы прилипают к дозатору
наконечников во время переноса, это может снизить количество фаговых частиц, присутствующих в
образец переносят в бланк следующего разведения.Один из способов минимизировать эту проблему — зарядить дозатор
пипетирование образца раствора вверх и вниз в наконечник и выгрузка
образец обратно в исходную пробирку. А
свежий образец затем может быть взят из той же пробирки и использован для переноса в
бланк следующего разведения. Покрытие
частицы фага, уже приставшие к стенкам наконечника, должны минимизировать потери
во втором примере.

смешивание фагов:

Поскольку верхний агар представляет собой вязкий раствор, стандартное перемешивание
имеет тенденцию вводить пузырьки воздуха в среду, что может быть затруднительно
отличить от фаговых бляшек.К
уменьшить количество пузырьков воздуха в результате смешивания расплавленных растворов агара
следует смешивать, используя соответствующую технику. Точный метод использования будет зависеть от типа трубки, которую необходимо использовать.
образцы подготовлены в.

Метод, называемый смешиванием фагов, был разработан для
образцы в стандартных стеклянных пробирках.
Это делается, удерживая трубку с колпачком в ладони, и
пальцы крепко держатся за трубку.
Трубку держат под углом 45 ° и вращают по кругу 4-6 раз в 1-2 раза.
секунд.(Трубка должна оставаться на 45
при вращении это будет продемонстрировано в классе.)
тщательное перемешивание с минимальным введением пузырьков.

Если образцы приготовлены в пластиковых пробирках объемом 4 мл с
защелкивающиеся колпачки (как и в этой лабораторной работе), наиболее эффективный метод
смешивание растворов будет заключаться в плотном закрытии пробирок и осторожном переворачивании
пробирки 4-6 раз за 2-3 секунды. Делать
не перемешивайте дольше этого, так как агар начнет остывать и затвердевать.

Разведения:

Предоставляются аликвоты фагов: ¹ / ₁₀
разведения (в SM) исходного запаса фага, имеющего от 10 ⁷
и 10 ⁸ БОЕ / мл. (pfu =
бляшкообразующие единицы — это жизнеспособные фаговые частицы, способные инфицировать
восприимчивые клетки-хозяева). Рассчитать
Вам потребуется разведения, чтобы получить окончательное количество 50-500 бляшек на пластину. (Обратите внимание, что 0,100 мл раствора фага будет
быть добавленным к верхним бланкам агара, это эквивалентно дополнительному количеству ¹ / ₁₀
этап разбавления.)

Разведения будут проводиться с использованием SM (суспензионная среда). Это связано с тем, что лямбда-капсиды фагов требуют
Ионы Mg ²⁺ для стабильности. Если
разведения производятся в dH ₂ O (или особенно TE, который содержит EDTA, a
хелатирующий агент для двухвалентных катионов) количество жизнеспособных фагов будет уменьшено.

Материалы и методы

Материалы

¹ / ₁₀ разведение (в SM) исходного фага (Ch5
с P.ochraceus Eco RI геномная библиотека)

1 мл E. coli C600

(получен выращиванием ночной культуры в 10 мл среды LB
содержащий 100 микролитров, стерилизованный фильтром 20% мальтозы, затем центрифугирование и
ресуспендирование в 10 мл SM)

SM (средняя подвеска)

NaCl 5,8 г

MgSO ₄ 7 H ₂ O 2 г

1 M Трис, pH 7,5 50 мл

2% (мас. / Об.) Раствор желатина 5 мл

dH ₂ O до 1 л

Пластиковые пробирки Falcon 4 мл

Верхний агар

LB (плавлен в микроволновой печи, охлажден до 50 ° C в
водяная баня)

не удалять из воды
ванна непосредственно перед использованием

одноразовые пипетки

чашки LB (предварительно нагретые в инкубаторе 37C

)

E.coli Базовая пластина C600

Методы Часть I Разведение фага

1. Получите необходимое количество LB
чашки, чтобы позволить 1 чашку LB для каждого разведения фага в диапазоне, ожидаемом
производить действительное количество тарелок. (Плиты
предварительно нагретый до 37C
инкубатор.) Надлежащим образом промаркируйте чашки,
и верните их в инкубатор 37C. (Этикетки должны включать название группы, дату, разведение фага и среду
использовался.) (Верхний агар не схватывается так быстро
на предварительно нагретых пластинах LB это позволит фаговым покрытиям распространяться больше
равномерно.)

2. Подготовить серийный номер ¹ / ₁₀
или ¹ / ₁₀₀ разведений исходного фага с использованием 0,9 мл или
Заготовки SM 0,99 мл. Первое разведение
должно быть разбавлением ¹ / ₁₀₀ , чтобы минимизировать объем
использован исходный фаговый запас. Разведения в
ожидаемый диапазон для получения действительного количества планшетов должен составлять ¹ / ₁₀
разведений. (Точное количество
Пробирки будут зависеть от количества разведений, которые вы запланировали в своем разведении.
схема.) Потери фага могут быть уменьшены
используя зарядку насадок (см. введение).
Разведения следует проводить в асептических условиях.

3. Перенесите по 0,100 мл каждого фага.
тестируемое разведение в пробирку Falcon объемом 4 мл.

4. Добавьте 0,100 мл бактериальной культуры в
0,100 мл образцов фага. Коротко перемешайте,
и инкубируйте при комнатной температуре в течение 15 минут.

5. Добавьте 3 мл верхнего агара в пробирки. Аккуратно перемешайте пробирки и сразу же залейте
на предварительно нагретые пластины LB.Распространение
наложение поперек пластины путем наклона и поворота пластины до тех пор, пока наложение не будет
равномерно распределены. Ободок
Пробирку с образцом также можно использовать для распределения наложения и лопания любых пузырьков, которые
настоящее время. Не пытайтесь распространять
наложите дальше, как только он начнет схватываться.
Это создаст зернистый непрозрачный слой, на котором будут образовываться бляшки.
трудно увидеть.

6. Дайте чашкам остыть, пока агар не остынет.
набор. Переверните тарелки (крышкой вниз),
и инкубировать 12-24 часа при 37 ° C.Подсчитайте свой
планшетов, запишите результаты в лабораторную книгу и рассчитайте концентрацию
pfu в исходном складе.

Часть II
Штрихи для изолированных колоний

Перенос одиночной колонии из E. coli C600
на чашку с правильно маркированной LB и штрих для изолированных колоний. (Если вы не знакомы с техникой
для этого попросите ТА для демонстрации.)

Вопросы для изучения

1.Что это
концентрация фага (в БОЕ / мл) исходного запаса фага?

(Покажите свой
расчет.)

2. Где находится
ближайшая: станция промывки глаз

огнетушитель

душ

3. Согласно листам паспортов безопасности материалов, какие
меры предосторожности необходимо использовать с фенолом и акриламидом?

4. Сколько сахарозы потребуется для
сделать 100 мл 0,1% раствора?

5.Сколько NaCl (58,44 г / моль) будет
нужно для приготовления 500 мл 2 мМ раствора NaCl?

6. Как приготовить 100 мл 0,2 N раствора NaOH, 1% SDS, используя
два стандартных решения, перечисленных ниже?

5 н. NaOH

10% SDS

7. Сколько в 100 мг / мл ампициллина в запасе?
следует добавить к 200 мл среды, чтобы получить конечную концентрацию 50 мкг / мл?

границ | Характеристика литических бактериофагов, инфицирующих мультирезистентные токсикогенные шига шига атипичные штаммы Escherichia coli O177, выделенные из фекалий крупного рогатого скота

Введение

Бактериофаги (фаги) представляют собой самовоспроизводящиеся вирусы, которые способны инфицировать и лизировать свои специфические бактерии-хозяева (1).Это вездесущие организмы на Земле, количество которых оценивается в 10 ³⁰ -10 ³² (2). Фаги относительно безопасны, нетоксичны и безвредны для животных, растений и человека (3, 4). Они встречаются в различных средах, связанных с их хозяином, например, в пище, почве, сточных водах, фекалиях и на фермах (2). Несколько видов бактерий, таких как Campylobacter, Escherichia coli, Listeria, Salmonella, Pseudomonas и Vibrio , используются в качестве хозяев для выделения их специфических бактериофагов (5–7).Из-за своей специфичности к хозяину и нетоксичности литические фаги считаются альтернативным решением для борьбы с устойчивыми к противомикробным препаратам патогенами. В Южной Африке были зарегистрированы вспышки листериоза и широкое распространение множественной лекарственной устойчивости у видов E. coli, Salmonella и Staphylococcus (8–11). Однако не было попыток использовать бактериофаги для борьбы с устойчивыми к антибиотикам патогенами ни в больницах, ни в пищевой промышленности.

Устойчивость к антибиотикам патогенов пищевого происхождения, особенно E.coli , остается проблемой общественного здравоохранения. Патогены, устойчивые к антибиотикам, не только увеличивают экономические и социальные издержки, но также вызывают тяжелые инфекции у людей (12). В 2014 году инфекции пищевого происхождения стали причиной около 600 миллионов заболеваний и 420 000 смертей во всем мире (13). Кроме того, с 2017 по 2018 год в Южной Африке было зарегистрировано 978 случаев листериоза, в результате которых погибло 183 человека (11). Ведущими патогенными бактериями, вызывающими озабоченность, являются видов E. coli O157, Campylobacter, Listeria и Salmonella (14).Более того, недавние сообщения показали, что штаммы, не относящиеся к O157, особенно O26, O45, O103, O111, O121 и O145, проявляют множественную лекарственную устойчивость и являются одной из основных причин инфекций пищевого происхождения (15).

С учетом вышеизложенного, для борьбы с инфекциями пищевого происхождения и распространением устойчивых к антибиотикам патогенов было разработано и реализовано несколько вмешательств, таких как физические, химические и биологические методы, на всех уровнях пищевой цепи (16). Однако эти традиционные методы имеют существенные недостатки, такие как коррозия предприятий пищевой промышленности, загрязнение окружающей среды, изменение пищевых матриц, развитие устойчивости к антибиотикам и токсические эффекты химических остатков (17).Кроме того, применение химических агентов в сочетании с отсутствием эффективных нормативных актов в отношении пищевых продуктов может затруднить международную торговлю и, таким образом, повлиять на экономику страны-экспортера (16, 18). Следовательно, отсутствие новых антибиотиков и неэффективность традиционных стратегий борьбы с бактериальными патогенами с множественной лекарственной устойчивостью требует поиска альтернативных стратегий контроля, таких как использование бактериофагов. Учитывая их биологические свойства, как объяснено выше, литические фаги могут применяться на всех уровнях пищевой цепи, включая внесение перед сбором урожая.Вмешательство перед уборкой урожая имеет то преимущество, что предотвращает передачу болезнетворных микроорганизмов пищевого происхождения от животных, производящих пищу, к человеку.

Принимая во внимание профили вирулентности и устойчивости к антибиотикам штамма E. coli O177, в сочетании с отсутствием новых антибиотиков и ограничениями традиционных стратегий снижения устойчивости к антибиотикам, существует потребность в расширении поиска новых бактериофагов для применения в биоконтроле. Таким образом, настоящее исследование было разработано для выделения и характеристики литического E.coli O177-специфические бактериофаги как потенциальные агенты биоконтроля. Стабильность и жизнеспособность фагов определяли при температурах и диапазонах pH, которые могут быть получены у живых жвачных животных, чтобы оценить их стабильность для использования у этих животных перед сбором урожая.

Материалы и методы

Бактериальный штамм

Мультирезистентный и вирулентный атипичный энтеропатогенный штамм E. coli O177 был использован для выделения E. coli O177-специфических бактериофагов.Атипичные энтеропатогенные изоляты E. coli O177 были получены из фекалий крупного рогатого скота и подтверждены с помощью ПЦР-анализа. Изоляты были дополнительно проверены на наличие детерминант вирулентности и антимикробных генов. Перед выделением фага 40 изолятов E. coli O177, хранившихся при -80 ° C, реанимировали на агаре MacConkey и инкубировали при 37 ° C в течение 24 часов. Отдельную колонию из каждого образца переносили в 15 мл питательного бульона в 50 мл пробирках Falcon. Образцы инкубировали в шейкере (160 об / мин) при 37 ° C в течение 3 часов, пока рост не достигал оптической плотности (OD) 0.4–0,5 (600 нм).

Обогащение и выделение Очистка

E. coli O177-специфических бактериофагов

Escherichia coli O177-специфические бактериофаги были выделены из фекалий крупного рогатого скота с использованием экологического штамма E. coli O177 по методу обогащения (19, 20) с некоторыми модификациями. Двадцать образцов фекалий были собраны с двух коммерческих откормочных площадок и двух молочных ферм. Образцы были собраны непосредственно из прямой кишки с использованием ректальных перчаток на расстоянии вытянутой руки, помещены в холодильник, содержащий пакеты со льдом, и доставлены в лабораторию.Пять граммов каждого образца фекалий растворяли в 20 мл разбавителя лямбда и встряхивали для получения гомогенной смеси. Смесь центрифугировали при 10000 × g в течение 10 мин с использованием Hi Centrifuge SR (модель: Z300, Германия) для осаждения фекалий и других примесей. Аликвоту 10 мл супернатанта экстрагировали и стерилизовали фильтрованием, используя шприц-фильтр с размером пор 0,22 мкм (GVS Filter Technology, США), чтобы получить неочищенные фильтраты фагов. Для обогащения 5 мл каждого фильтрата добавляли к 100 мкл экспоненциальной фазы (OD ₆₀₀ = 0.4–0.5) культуры каждого из 40 штаммов-хозяев E. coli O177 в 10 мл трипсинового соевого бульона (TSB) двойной концентрации с добавлением 2 мМ хлорида кальция (CaCl ₂ ). Образцы инкубировали в инкубаторе со встряхиванием (80 об / мин) при 37 ° C в течение 24 часов. После инкубации образцы центрифугировали при 10000 × g в течение 10 минут с использованием Hi Centrifuge SR (модель: Z300, Германия) для удаления бактериальных клеток и остатков образцов. Супернатант стерилизовали фильтрованием с помощью шприцевого фильтра Acrodisc с размером пор 0,22 мкм (GVS Filter Technology, США), чтобы получить неочищенные фильтраты фагов.

Затем был проведен спот-тест для определения присутствия фагов, как описано ранее (19). Вкратце, 100 мкл экспоненциально-фазовой (OD ₆₀₀ = 0,4-0,5) культуры бактериального хозяина смешивали с 3 мл мягкого агара (0,3% агара в / в), выдерживаемого при 50 ° C, затем выливали на модифицированное питательное вещество. чашки с агаром (MNA), чтобы создать бактериальный газон, и дали затвердеть в течение 15 мин. Десять микролитров каждого неочищенного фильтрата фага наносили на бактериальный газон, и планшеты инкубировали при 37 ° C в течение 24 часов.После инкубации планшеты наблюдали на наличие прозрачных зон или бляшек в точках инокулирования. Бляшки собирали с помощью стерильного наконечника пипетки и суспендировали в 1 мл лямбда-разбавителя [10 мМ Tris Cl (pH 7,5), 8 мМ MgSO ₄ · 7H ₂ O] в 2-мкл пробирках Эппендорфа. Пробирки оставляли при комнатной температуре, чтобы фаги могли диффундировать в раствор. Затем пробирки центрифугировали при 11000 × g в течение 10 минут, и супернатант стерилизовали фильтрованием с 0.Шприцевой фильтр Acrodisc с размером пор 22 мкм (GVS Filter Technology, Германия).

Очистка и размножение бактериофагов

Бактериофаги были очищены от одиночных изолятов бляшек методом наложения мягкого агара (21, 22). Был проведен анализ зубного налета, и планшеты инкубировали при 37 ° C в течение 24 часов. После инкубации отдельные бляшки с каждого планшета отбирали в зависимости от их размера и прозрачности с помощью стерильного наконечника пипетки и ресуспендировали в 1 мл разбавителя лямбда в 2-мкл пробирках Эппендорфа.Пробирки оставляли при 4 ° C на 24 часа, чтобы фаг мог диффундировать в буфер. Затем пробирки центрифугировали при 10000 × g в течение 10 мин, и супернатант стерилизовали фильтрованием с использованием шприцевого фильтра Acrodisc с размером пор 0,22 мкм (GVS Filter Technology, Германия). Процесс очистки повторяли три раза подряд до получения гомогенных бляшек для каждого изолята фага. Очищенные фаги размножали с использованием бактерий-хозяев E. coli O177. Сто микролитров исходных чистых фагов смешивали со 100 мкл экспоненциальной фазы (OD ₆₀₀ = 0.4–0.5) культура соответствующего хозяина (ов) в 50 мл пробирке сокола, содержащей 10 мл стерильного TSB двойной концентрации с добавлением 2 мМ CaCl ₂ . Смесь инкубировали в инкубаторе со встряхиванием (150 об / мин) при 37 ° C в течение 24 часов. После инкубации образцы центрифугировали при 8000 × g в течение 10 минут при 4 ° C, и супернатант стерилизовали фильтрованием с использованием шприцевого фильтра Acrodisc с размером пор 0,22 мкм (GVS Filter Technology, Германия). Готовили десятикратные серийные разведения, титры фагов определяли с помощью анализа бляшек и титры выражали в БОЕ на миллилитр.Исходные фаги хранили при 4 ° C для дальнейшего анализа.

Характеристика выбранных

E. coli О177-специфических бактериофагов

Диапазон хозяев и перекрестная инфекция фаговых изолятов

Диапазон хозяев восьми выбранных изолятов фагов был оценен против 50 бактериальных хозяев [13 E. coli O177, 12 E. coli O157, 12 E. coli O26 и 10 видов Salmonella (экологические штаммы) , 1 Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853), 1 Salmonella enterica (ATCC 12325) и 1 Salmonella typhimurium (ATCC 14028)], и все виды окружающей среды были изолированы из фекалий крупного рогатого скота.Изоляты фагов были отобраны на основании различной морфологии бляшек и их прозрачности и размеров. Для определения литического спектра активности каждого изолятов фага использовалась методика точечных тестов, как описано ранее (21). Бактериальные газоны всех выбранных бактериальных хозяев готовили на чашках MNA. Десять микролитров исходного фага (10 ⁷ –10 ⁹ БОЕ / мл) наносили на бактериальный газон и оставляли для высыхания на воздухе в ламинарном потоке воздуха в течение 10 мин. Планшеты инкубировали при 37 ° C в течение 24 часов.После инкубации планшеты наблюдали на наличие бляшек в месте нанесения, и литические профили фагов были разделены на три категории в соответствии с их прозрачностью: прозрачные, мутные и отсутствие лизиса (23). Тест проводили в трех экземплярах для каждого изолята фага.

Эффективность посева фагов

Эффективность посева (EOP) выполняли для определения литической эффективности фага по сравнению с подходящими для них бактериями-хозяевами, как описано ранее (24), с модификацией.Пятнадцать бактериальных штаммов (пять E. coli O177, пять E. coli O26 и пять E. coli O157) были отобраны на основании их чувствительности к фагам. Готовили десятикратные серийные разведения фагов для получения единичных бляшек. Аликвоту по 100 мкл каждого фага (1 × 10 ⁴ БОЕ / мл) смешивали со 100 мкл экспоненциально-фазовой (OD ₆₀₀ = 0,4–0,5) культуры каждой бактерии в 50-мл стерильных пробирках Falcon и оставили на 10 мин при комнатной температуре, чтобы фаг мог прикрепиться к хозяину.Затем в пробирку добавляли 3 мл мягкого агара (0,3% мас. / Об.) И смесь выливали на планшеты с MNA. Для каждого изолята фага проводили три независимых анализа. После затвердевания планшеты инкубировали при 37 ° C в течение 24 часов. После инкубации подсчитывали количество бляшек на чашку. EOP рассчитывали как отношение между средним числом бляшек на бактериях-мишенях (БОЕ) и средним числом бляшек эталонных бактерий-хозяев (БОЕ). EOP был классифицирован как высокий (EOP ≥ 0.5), умеренной (EOP> 0,01 <0,5) и низкой (EOP ≤ 0,1) в зависимости от воспроизводимой инфекции целевых бактерий (25). Для расчета значений EOP использовалась следующая формула:

Относительный EOP = среднее количество бляшек на целевых бактериях-хозяевах (БОЕ), среднее количество бляшек на эталонных бактериях-хозяевах (БОЕ)

Анализ с помощью просвечивающей электронной микроскопии

Восемь изолятов фага подвергали просвечивающей электронной микроскопии (ТЕМ), и морфотип фага определяли с использованием методов отрицательного окрашивания, как описано ранее (26), с некоторыми модификациями.Вкратце, фаги размножали для получения высокого титра (10 ⁸ –10 ¹¹ БОЕ / мл). Десять миллилитров каждого фага (10 ⁸ –10 ¹¹ БОЕ / мл) концентрировали в 50-миллилитровых пробирках сокола, добавляя 10% (мас. / Об.) ПЭГ, и смесь инкубировали при 4 ° C в течение ночи, чтобы позволить осаждение фаговых частиц. После инкубации частицы фага осаждали центрифугированием при 11000 × g в течение 10 мин при 4 ° C. Супернатант сливали, а осадок трижды промывали 0.1 М ацетат аммония (pH 7,0). Осадок ресуспендировали в 200 мкл ацетата аммония. Десять микролитров концентрированного раствора фага наносили на медные сетки размером 200 меш с покрытыми углеродом пленками из формвара. Фаговым частицам давали адсорбироваться в течение 2 минут, а избыток жидкости сливали стерильной фильтровальной бумагой. Решетке дали высохнуть на воздухе. Добавляли каплю 1% (мас. / Об.) Молибдата аммония (водный, pH 6,5) для отрицательного окрашивания фаговых частиц и оставляли для высыхания на воздухе в течение 10–15 мин.Сетка, содержащая образец (фаговые частицы), затем загружалась в просвечивающий электронный микроскоп (модель: FEI Tecnai; ТЕМ, Чешская Республика) и работала при 120 кВ для сканирования и просмотра изображений фага с диапазоном увеличения 20 000–100 000. Микрофотографии были сделаны камерой Gatan, установленной снизу, с использованием программного обеспечения Digital Micrograph при 80 кВ и диапазоне увеличения 20 000–250 000 раз. Были сделаны изображения, и морфологические характеристики были использованы для классификации изолятов фагов, как описано ранее (27).

Влияние различных температур и pH на стабильность и жизнеспособность фагов

Стабильность и жизнеспособность фага оценивали при различных температурах (37 и 40 ° C) в течение 60-минутного периода в термостатируемом инкубаторе. Перед началом эксперимента была стандартизирована концентрация бактерий-хозяев и титры фагов. Сто микролитров экспоненциально-фазовой культуры [10 ⁵ колониеобразующих единиц (КОЕ) / мл] и 100 мкл фагов (10 ⁵ БОЕ / мл) добавляли к 10 мл TSB двойной концентрации с добавлением 2 мМ CaCl ₂ .Пробирки инкубировали в предварительно установленном инкубаторе со встряхиванием при 37 и 40 ° C в течение 60 минут, образцы отбирали через 10, 30 и 60 минут инкубации и оценивали жизнеспособность и концентрацию с использованием двухслойного агара (22). Анализ зубного налета проводили в трех экземплярах для каждого образца, и результаты выражали в БОЕ на миллилитр. Что касается pH, фаги подвергались воздействию различных уровней pH (3,0, 4,5, 6,3, 7,0, 8,5 и 10,0) в течение 48-часового инкубационного периода. Десять миллилитров стерильного TSB двойной концентрации (с поправкой на 2 мМ CaCl ₂ ) были распределены в 50-миллилитровые пробирки Falcon для приготовления растворов с различным pH.PH регулировали с помощью соляной кислоты (HCL, 6M) или гидроксида натрия (NaOH, 6M). Сто микролитров каждого бактериального хозяина (10 ⁵ КОЕ / мл) и их соответствующих изолятов фага (10 ⁵ БОЕ / мл) добавляли к 10 мл. Пробирки инкубировали в предварительно установленном инкубаторе со встряхиванием (80 об / мин) при 37 ° C в течение 48 часов. Образцы отбирали через 24 и 48 ч инкубации, и титр фага для каждого образца определяли с помощью стандартного анализа бляшек. Анализ зубного налета проводили в трех экземплярах для каждого образца, и результаты выражали в БОЕ на миллилитр.

Кривая одношагового роста

Эксперимент с одноэтапной кривой роста был проведен для определения латентного периода и размера взрыва выбранных фагов, как описано ранее (21), с некоторыми модификациями. Вкратце, 5 мл экспоненциально-фазовой культуры каждого хозяина центрифугировали при 8000 × g в течение 5 минут при 4 ° C. Поддон ресуспендировали в 10 мл TSB двойной концентрации с добавлением 2 мМ CaCl ₂ до получения OD 0,4–0,5 (600 нм). Концентрацию бактерий доводили с использованием стерильного TSB двойной концентрации для получения 1 × 10 ⁸ КОЕ / мл.Каждый фаг (10 ⁸ БОЕ / мл) добавляли к соответствующей бактериальной суспензии хозяина для достижения множественности инфекции (MOI) 1,0. Смесь оставляли при комнатной температуре на 10 мин, чтобы фаги адсорбировались на бактериях-хозяевах. Через 10 мин 1,5 мкл смеси переносили в 2-мкл пробирки Эппендорфа и центрифугировали при 11000 × g в течение 10 мин для удаления неадсорбированных фаговых частиц. Осадок ресуспендировали в 100 мкл TSB с добавлением 10 мМ сульфата магния (mTSB) и переносили в 9.9 мл предварительно подогретого mTSB. Образцы инкубировали в инкубаторе со встряхиванием (160 об / мин) при 37 ° C в течение 1 ч. Двести микролитров отбирали из каждого образца с 5-минутными интервалами в течение 60 минут. Анализ бляшек проводили в трех экземплярах для каждого образца для определения титра фага. Полученные данные использовались для определения латентного периода, времени всплеска и относительного размера всплеска фага на инфицированную клетку. Размер всплеска рассчитывали как отношение окончательного количества выпущенных потомков фага к начальному количеству инфицированных бактериальных клеток-хозяев в латентный период с использованием следующей формулы, как описано ранее (28):

Относительный размер взрыва = конечный титр (БОЕ) — начальный титр (БОЕ) начальный титр (БОЕ) (БОЕ)

Относительный размер пакета в различные моменты времени был нанесен на график в зависимости от времени, чтобы определить латентный период и размер пакета каждого изолята фага.

Статистический анализ

Жизнеспособность и стабильность фагов проверяли при различных температурах и уровнях pH. Данные были преобразованы в log ₁₀ БОЕ на миллилитр и проанализированы с использованием SAS (2010). Влияние температуры, времени и типа фага на жизнеспособность и стабильность фагов анализировали с использованием процедуры общей линейной модели (GLM) SAS (2010) для факторной обработки 2 (температура) × 3 (время) × 8 (фаги). компоновка по следующей модели:

Yijkl = μ + Ti + Sj + Vk + (T × S) ij + (T × V) ik + (S × V) jk + (T × S × V) ijk + Eijkl

, где Y _ijkl — наблюдение зависимой переменной ijkl ; μ — фиксированный эффект среднего значения для переменной; T _i — влияние температуры; S _j — эффект времени; V _k — действие фагов; ( T × S ) _ij — эффект взаимодействия между температурой на уровне i и временем на уровне j ; ( T × V ) _ik — эффект взаимодействия между температурой на уровне i и фагом на уровне k ; ( S × V ) _jk — это эффект взаимодействия между временем на уровне j и фагом на уровне k ; ( T × S × V ) _ijk — это эффект взаимодействия между температурой на уровне i , временем на уровне j и фагом на уровне k ; и E _ijkl — случайная ошибка, связанная с наблюдением ijkl .

Данные о жизнеспособности и стабильности фагов в ответ на возрастающие уровни pH были оценены на предмет линейных и квадратичных эффектов с использованием полиномиальных контрастов. Регрессионный анализ поверхности отклика (Proc RSREG; SAS 2010) был применен для описания откликов на pH в соответствии со следующей квадратичной моделью: y = a + bx + cx ² , где y — переменные отклика, b и c — коэффициенты квадратного уравнения, a — точка пересечения, x — уровень pH, и — b /2 c — значение x для максимального отклика.Для всех статистических тестов значимость была заявлена ​​на уровне p ≤ 0,05.

Результаты

Выделение, очистка и размножение бактериофагов

Тридцать один литический E. coli O177-специфический бактериофаг был выделен из фекалий крупного рогатого скота. Фаги были способны инфицировать 15% изолятов E. coli O177, использованных для выделения. Изоляты фагов были обозначены как ECPV в соответствии с родом бактерий-хозяев, с последующим обозначением фагового вируса и числовым номером в качестве идентичности.Изоляты фагов выявили различную морфологию бляшек с точки зрения размеров, от маленьких до больших (1-2 мм, соответственно) бляшек (рис. 1). Большая часть (71%) изолятов фагов выявила большие бляшки, в то время как небольшая часть (29%) показала маленькие бляшки на их предпочтительных хозяевах. Все фаги выявляли прозрачные (полный лизис) бляшки, и никаких мутных бляшек не наблюдалось. Титр фага после размножения варьировал от 6,2 × 10 ⁵ до 3,1 × 10 ¹³ БОЕ / мл. Фаг EC3A2PV имел самый низкий титр, тогда как фаг EC198B1PV имел самый высокий титр по сравнению с другими изолятами фага.

Рисунок 1 . Репрезентативное изображение фаговых изолятов, изображающих различные морфологии бляшек: (A) EC198B2PV (большие бляшки) и (B) EC3B1PV (маленькие бляшки).

Диапазон фагов-хозяев и анализ EOP в отношении различных штаммов E. coli

Точечный тест был проведен для определения диапазона хозяев восьми выбранных изолятов литических фагов против 50 бактериальных хозяев, включающих различные виды бактерий. Результаты показали, что фаги способны инфицировать E.coli видов ( E. coli O177, E. coli 0157 и E. coli O26 штаммы окружающей среды) (рис. 2). Все фаговые изоляты продуцировали прозрачные бляшки против всех E . coli O177 и 83–100% из штаммов E. coli O26 (таблица 1). Три фага (EC10C3PV, EC11B2PV и EC12A1PV) были способны инфицировать E. coli, O157 (75–83%; таблица 2). Ни один из фагов не может инфицировать штаммы ATCC и виды Salmonella в окружающей среде.Анализ EOP был проведен на 15 изолятах (пять E. coli O177, пять E. coli O26 и пять E. coli O157), которые были чувствительны к фагам в тесте на пятнах. Хотя результаты точечного теста выявили прозрачные бляшки на E. coli O177, результаты EOP показали различные литические паттерны фагов. Несмотря на то, что анализ EOP выявил высокую (EOP ≥ 0,5) продуктивную инфекцию на E. coli O177, наблюдались умеренные инфекции (Таблица 2). Четыре фага показали высокие значения EOP (0.5–0.8) на изолятах E. coli O177. С другой стороны, анализ EOP выявил умеренную и низкую продуктивность инфекций у изолятов E. coli O26 и E. coli O157 (значения EOP варьируются от 0,0 до 0,4 и от 0,0 до 0,3, соответственно).

Рисунок 2 . Репрезентативное изображение, показывающее результаты точечного тестирования фагов на различных штаммах Escherichia coli .

Таблица 1 . Инфекция фагами в диапазоне хозяев.

Таблица 2 .Эффективность посева фагов против различных серотипов Escherichia coli .

Морфологическая характеристика фагов на основе TEM

Восемь отобранных изолятов фагов подвергали ТЕМ-анализу для определения их морфотипа. Просвечивающие электронные микрофотографии фагов и структурные размеры показаны на фиг. 3 и в таблице 3 соответственно. Изоляты фагов были классифицированы в соответствии с классификацией Международного комитета по таксономии вирусов (ICTV) на основе наблюдаемой трехмерной структуры.Все фаговые изоляты показали сходный морфотип при ТЕМ-анализе. Структурно фаги имели икосаэдрическую голову и шейку, прикрепленную к длинному сократительному хвосту с хвостовыми волокнами, и они были классифицированы под отрядом Caudovirales, семейство Myoviridae . Размер икосаэдрических головок фагов составлял от 81,2 ± 6 до 95,6 ± 3 нм, а сократительных хвостов — от 118,1 ± 0,3 до 135 ± 2 нм. Фаг EC10C2PV имел самую длинную икосаэдрическую голову диаметром 95,6 ± 3 нм и самый длинный сократительный хвост 135 ± 2 нм с волокнами.Фаг EC10C3PV имел самую маленькую икосаэдрическую головку диаметром 81,2 ± 6 нм и самый короткий сократительный хвост 118,1 ± 0,3 нм с волокнами.

Рисунок 3 . Просвечивающие электронные микрофотографии репрезентативных изолятов фагов, отрицательно окрашенных 1% молибдатом аммония. Оба фага ( A : EC11B2PV; B : EC118BPV) принадлежат к семейству myoviridae и демонстрируют икосаэдрический капсид и длинный сократительный хвост с хвостовыми волокнами. Полоски указывают масштаб (100 нм).

Таблица 3 . Размеры фагов на основе анализа просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ).

Стабильность и жизнеспособность фагов при различных температурах

Результаты показали значительное ( p <0,001) влияние взаимодействия время × температура на стабильность и жизнеспособность фагов. Инкубация фагов от 10 до 60 мин приводила к значительному росту фагов при 37 ° C (рис. 4). Прирост с 10 до 30 минут составил от 8,55 до 8.75 log ₁₀ БОЕ / мл (при 37 ° C). Фаг EC3A1PV показал самую низкую скорость роста, тогда как фаг EC10C3PV показал самую высокую скорость роста от 10 до 60 минут. Рост фагов при 40 ° C при инкубации в течение 10-60 мин показан на фиг. 5. За период от 10 до 30 мин семь фагов показали значительную скорость роста (в диапазоне от 8,71 до 9,13 log ₁₀ БОЕ / мл). Наблюдалось снижение скорости роста фага EC12A1PV (с 10 до 60 минут), в то время как два фага (EC10C2PV и EC10C3PV) демонстрировали снижение скорости роста с 30 до 60 минут инкубационного периода.

Рисунок 4 . Влияние времени на устойчивость (стабильность / выживаемость) отдельных фагов при 37 ° C. Планки погрешностей представляют собой стандартное отклонение. PFU, бляшкообразующий агрегат.

Рисунок 5 . Влияние времени на устойчивость (стабильность / выживаемость) отдельных фагов при 40 ° C. Планки погрешностей представляют собой стандартное отклонение. PFU, бляшкообразующий агрегат.

Воздействие на отдельные фаги 37 ° C в течение 10–30 мин показало значительное увеличение скорости роста со временем (0.Скорость роста 4–2,3% при 37 ° C; Рисунки 6, 7). Средняя скорость роста фагов увеличилась с 0,2 до 0,17 log ₁₀ БОЕ / мл при 37 ° C (10–30 мин инкубационного периода). Фаги показали различные ответы при инкубации при 40 ° C. Наблюдалось снижение скорости роста других фагов. При инкубации в течение 10 минут при 40 ° C скорость роста EC10C3PV снизилась больше всего на 4,8%, в то время как скорость роста фага EC3A1PV пострадала меньше всего, показав снижение только на 0,2%. После 30 мин инкубации у фагов EC366BPV (0.2%), EC366VPV (0,2%) и EC10C3PV (2,4%) (рисунок 7). При инкубации в течение 60 мин при 40 ° C фаги EC10C2PV (0,28 log ₁₀ БОЕ / мл), EC10C3PV (0,39 log ₁₀ БОЕ / мл) и EC12A1PV (0,37 log ₁₀ БОЕ / мл) показали наибольшую снижение темпов роста по сравнению с их соответствующими темпами в течение 60 минут при 37 ° C (Рисунок 8).

Рисунок 6 . Выживаемость и стабильность отдельных фагов при воздействии различных температур в течение 10 мин. Планки погрешностей представляют собой стандартное отклонение.PFU, бляшкообразующий агрегат.

Рисунок 7 . Выживаемость и стабильность отдельных фагов при воздействии различных температур в течение 30 мин. Планки погрешностей представляют собой стандартное отклонение. PFU, бляшкообразующий агрегат.

Рисунок 8 . Выживаемость и стабильность отдельных фагов при воздействии различных температур в течение 60 мин. Планки погрешностей представляют собой стандартное отклонение. PFU, бляшкообразующий агрегат.

Стабильность и жизнеспособность фагов при различных уровнях pH

Регрессионный анализ поверхности ответа выявил квадратичные эффекты ( p <0.0001) от pH на стабильность фага при инкубации в течение 24 и 48 часов (рисунки 9A – H, 10A1 – h2 соответственно). Оптимумы pH для всех фагов находились в диапазоне от 7,6 до 8,0 со значениями R ² в диапазоне от 0,90 до 1,0 при инкубации в течение 24 часов (рисунки 9A – H). Три фага показали максимальную стабильность при pH 8,0, определенную с помощью следующих квадратных уравнений: y = -13,9 (± 2,93) + 6,4 (± 0,98) x — 0,4 (± 0,07) x ² (EC10C2PV), y = −13.9 (± 3,04) + 6,4 (± 1,01) x — 0,4 (± 0,08) x ² (EC366BPV) и y = -13,9 (± 2,97) + 6,4 (± 0,99) x — 0,4 (± 0,08) x ² (EC366VPV). Фаги EC10C3PV и EC11B2PV показали максимальную стабильность при pH 7,6, что было определено с помощью следующих квадратных уравнений: y = -13,4 (± 2,87) + 6,1 (± 0,95) x — 0,4 (± 0,07) x ² и y = −13,5 (± 2,94) + 6,1 (± 0,98) x — 0.4 (± 0,07) x ² соответственно. При инкубации в течение 48 часов оптимумы pH для стабильности фага находились в диапазоне от 7,9 до 8,0 при значениях R ² в диапазоне от 0,90 до 1,0 (рисунки 10A1 – h2). Семь фагов показали максимальную стабильность при более высоком (8,0) оптимальном pH, в то время как только один фаг показал максимальную стабильность при более низком (7,9) pH, определенном с помощью квадратного уравнения y = -13,8 (± 3,10) + 6,3 (± 1,03) x — 0,4 (± 0,08) x ² .

Рисунок 9.(A – H) Взаимосвязь между pH ( x ) и стабильностью фагов [log ₁₀ бляшкообразующих единиц (БОЕ), y ] при инкубации при 37 ° C в течение 24 часов.

Рисунок 10. (A1 – h2) Взаимосвязь между pH ( x ) и стабильностью фагов [log ₁₀ бляшкообразующих единиц (БОЕ), y ] при инкубации при 37 ° C в течение 48 часов.

Одношаговая кривая роста бактериофагов

Одноступенчатый анализ кривой роста восьми изолятов фага выполняли для определения латентного периода и относительного размера взрыва на инфицированную бактериальную клетку.Полученные данные были проанализированы и использованы для построения трехфазных кривых (рисунки 5–11A – H). Латентный период для всех фагов составлял от 15 до 25 мин (в среднем = 20 ± 3,8 мин). Фаги EC11B2PV и EC3A1PV имели самый длинный латентный период (25 мин), а фаги EC118BPV и EC366VPV — самый короткий (15 мин) латентный период. Латентный период для остальных четырех фагов составил 20 мин. Что касается размера пачки, фаги EC10C3PV и EC12A1PV имели наибольший размер пачки на инфицированную клетку (522 и 367 БОЕ соответственно), тогда как фаг EC366VPV имел наименьший размер пачки (91 БОЕ) на инфицированную клетку.

Рисунок 11. (A – H) Одностадийные кривые роста для восьми Escherichia coli O177-специфичных изолятов фага. Скрытый период (L) и размер пакета (B). Планки погрешностей указывают стандартное отклонение.

Обсуждение

Появление устойчивости к антибиотикам у патогенов пищевого происхождения возродило интерес к возможному использованию литических бактериофагов в качестве альтернативной стратегии биоконтроля. Благодаря своей способности лизировать патогены с множественной лекарственной устойчивостью литические бактериофаги считаются естественной и зеленой технологией для сохранения и безопасности пищевых продуктов (29).Выделение, идентификация и полная характеристика бактериального хозяина является предпосылкой для успешного выделения подходящих литических бактериофагов, предназначенных для биоконтроля антимикробных патогенов пищевого происхождения (30). Кроме того, необходимо использовать надежные, воспроизводимые и эффективные методы для выбора подходящих фагов-кандидатов для применения в биоконтроле (31). В этом исследовании 31 литический изолятов E. coli O177-специфических бактериофагов был успешно выделен из фекалий крупного рогатого скота с использованием атипичных энтеропатогенных бактерий E.coli O177 в качестве хозяина. Поскольку крупный рогатый скот является основным резервуаром атипичного энтеропатогенного штамма E. coli O177, это подтверждает идею о том, что фаги присутствуют в каждой экосистеме, где существуют их хозяева (4). Фаги имели четкие и дискретные бляшки разного размера. Размер бляшек варьировал от малого до большого (1-2 мм, соответственно), а титры фагов — от 6,2 × 10 ⁵ до 3,1 × 10 ¹³ БОЕ / мл. Интересно, что большая часть (71%) изолятов фагов продуцировала большие и прозрачные бляшки на их предпочтительных хозяевах.Эти характеристики были аналогичны описанным для фагов, специфичных для E. coli O157-, Listeria -, Pseudomonas -, Salmonella — и Vibrio (23, 32, 33). С точки зрения биоконтроля, строго литические фаги с высокими титрами считаются идеальными кандидатами для применения в биоконтроле (4, 34).

Диапазон хозяев — один из наиболее важных критериев при выборе фагов, предназначенных для биоконтроля антимикробных патогенов пищевого происхождения (35).Для определения диапазона фаговых хозяев были выбраны восемь фагов. Критерии отбора основывались на литических профилях, прозрачности бляшек и размере фагов. Точечный тест показал, что фаги были способны инфицировать различные штаммы E. coli из двух разных категорий [атипичный энтеропатогенный в окружающей среде E. coli O177 и E. coli , продуцирующий токсин Shiga ( E. coli O26 и E. coli, O26 и E. coli O157)]. Ясные бляшки преимущественно наблюдались на E.coli O177 и E. coli O26 серотипов. Интересно, что три фага демонстрировали четкие бляшки на штаммах E. coli O177, E. coli O26 и E. coli O157, что позволяет предположить, что эти фаги были поливалентными и инфицировали штаммы из двух разных категорий. Несмотря на это, ни один фаг не смог заразить все штаммы ATCC и видов Salmonella из окружающей среды, протестированных в этом исследовании. Это может быть связано с тем, что штаммы ATCC и виды Salmonella не имеют специфических рецепторов для прикрепления фагов.На основании анализа EOP фаги показали высокую эффективность (EOP ≥ 0,5) на штамме E. coli O177. Несмотря на тот факт, что все фаги выявили четкие бляшки на штаммах E. coli, O26 и O157 в тесте на пятнах, только три фага показали EOP от среднего до низкого (<0,5) на серотипах E. coli O26 и O157. Это свидетельствует о высокой специфичности фагов к штамму E. coli O177. Более того, специфичность хозяина считается желательной характеристикой для сильного применения фагов, особенно у живых животных, чтобы гарантировать, что они оказывают незначительное влияние или не оказывают никакого влияния на полезную микрофлору кишечника (2, 6).Кроме того, вариабельность инфекционности может быть связана с неспецифическими связывающими рецепторами на стенке клетки-хозяина или наличием устойчивых к фагам штаммов (6).

Для ПЭМ-анализа использовали процедуру отрицательного окрашивания. По результатам ПЭМ все восемь изолятов фага выявили сходный морфотип. Конструктивно фаги имели икосаэдрическую голову и шейку, прикрепленную к длинному сократительному хвосту, а хвостовые волокна были соединены с опорной пластиной. Икосаэдрическая голова фагов составляла от 81,2 ± 6 до 95.6 ± 3 нм, сократительные хвосты — от 118,1 ± 0,3 до 135 ± 2 нм. На основании этих характеристик изоляты фагов были отнесены к отряду Caudovirales и семейства Myoviridae (27). Более того, эти характеристики были аналогичны таковым у T1-7-подобных фагов E. coli (4, 36). Учитывая тот факт, что семейство Myoviridae содержит двухцепочечные ДНК-фаги (4), все восемь фагов предположительно были отнесены к линейным двухцепочечным ДНК-фагам.Хвостовые волокна содержат белки, которые помогают фагу распознавать свои специфические рецепторы на стенке бактериальной клетки и, таким образом, ограничивают связывание фага с неспецифической бактериальной клеткой (37). Это объясняет специфичность фагов, выделенных в этом исследовании, в отношении хозяина.

Внешние факторы, такие как pH и температура, могут влиять на стабильность и инфекционность фагов (7). Эти факторы могут колебаться, особенно у живых животных, из-за диеты и / или температуры окружающей среды. В связи с этим фаги, предназначенные для применения в области биоконтроля, особенно у живых жвачных животных, должны тестироваться в соответствующем диапазоне pH и температуры.По этой причине оценивали влияние воздействия разных температур (37 и 40 ° C) в разное время на инфекционность и стабильность восьми фагов. Учитывая, что полный лизис бактерий фагом занимает 20–40 мин (33), рост фага при различных температурах контролировали через 10, 30 и 60 мин. Кроме того, температуры инкубации были выбраны потому, что температура в пищеварительной системе жвачных животных колеблется от 37 до 40 ° C. Способность фагов выживать при этих температурах предполагает, что они могут применяться на живых животных в качестве агентов биоконтроля.При инкубации при 37 ° C фаги показывали значительную скорость роста в каждый момент времени. Фаги EC10C3PV, EC11B2PV и EC366VPV показали самые высокие темпы роста; фаг EC3A1PV показал самую медленную скорость роста от 10 до 60 мин. Эти результаты аналогичны результатам предыдущих исследований (28).

Фаги показали различные модели роста при воздействии на них 40 ° C. Как правило, скорость роста фагов снижалась при 40 ° C по сравнению со скоростью роста при 37 ° C. При воздействии 40 ° C в течение 10–30 мин семь фагов показали значительную скорость роста.Однако один фаг показал снижение скорости роста через 30 минут, в то время как два фага, EC10C2PV и EC10C3PV, показали снижение только с 30 до 60 минут при 40 ° C. Это демонстрирует, что эти три фага были менее стабильны при высокой температуре, и поэтому их применение у живых животных ограничено, поскольку температура рубца составляет 39 ° C. Несмотря на это, другие пять фагов были довольно стабильны при 40 ° C, что позволяет предположить, что они могут быть пригодны для применения в биоконтроле живых животных.

Регрессионный анализ поверхности ответа выявил значительную взаимосвязь между pH и стабильностью фага.Оптимальный pH для фагов при разном времени инкубации составлял от 7,6 до 8,0 (24 ч) и от 7,9 до 8,0 (48 ч). При инкубации в течение 24 и 48 часов все фаги демонстрировали сходные тенденции роста и выживаемости в широком диапазоне pH (4,5–10,0). Несмотря на это, все фаги были чувствительны к низкому pH (3,0), и никакой активности не наблюдалось после 24 и 48 часов инкубации при этом pH. Это согласуется с предыдущими исследованиями, в которых сообщалось, что воздействие на фаги pH 3,0 и ниже значительно снижает жизнеспособность и стабильность фагов (38, 39).Хотя оптимальный pH для всех фагов составляет 7,6–8,0, фаги показали хорошую стабильность даже при более низких значениях pH 6,3 и 7,0, что соответствует значениям pH рубца (6,5–6,9). И это указывает на их потенциальную пригодность для использования в стратегиях предуборочного вмешательства, которые могут быть разработаны для применения на жвачных животных.

Латентный период фага и размер пакета являются важными параметрами, которые следует учитывать при выборе фагов для целей биоконтроля (5, 31). Фаги с коротким латентным периодом и большим размером взрыва более эффективны в инактивации бактерий и, таким образом, считаются подходящими для применения в биоконтроле (35).Одношаговые кривые роста показали, что восемь фагов имеют разные модели роста, что позволяет предположить, что они имеют разные генотипы. Они продемонстрировали выдающиеся характеристики, такие как короткий латентный период и большой размер бюста, что делает их привлекательными для контроля штамма E. coli O177. Латентный период фагов составлял от 15 до 25 мин, а размер пакета — от 91 до 522 БОЕ на клетку-хозяина. Кроме того, средний латентный период для всех фагов составлял 20 ± 3,8 мин, в то время как размер пакета составлял 260 ± 144 БОЕ на клетку-хозяина.Эти результаты соответствовали ранее опубликованным (35). Два фага, EC118BPV и EC366VPV, имели самый короткий латентный период (15 мин), тогда как EC11B2PV и EC3A1PV имели самый длинный латентный период (25 мин). Фаги EC10C3PV, EC118BPV и EC12A1PV имели наибольший размер пачки на инфицированную клетку (522 и 367 БОЕ на клетку-хозяина соответственно). Интересно, что эти три фага также показали широкий диапазон хозяев в спот-тесте. Это показывает, что эти фаги лучше подходят для применения в биоконтроле (40).

В заключение, в этом исследовании были успешно выделены литические бактериофаги, заражающие экологический штамм E. coli O177. Кроме того, фаги были способны инфицировать три штамма E. coli из двух разных категорий: атипичный энтеропатогенный E. coli ( E. coli O177) и E. coli , продуцирующий токсин Shiga ( E. coli ). O26 и E. coli O157). Несмотря на это, ни один фаг не смог заразить штаммы ATCC и протестированных видов Salmonella в окружающей среде.Учитывая сильную литическую активность, широкий спектр и стабильность при различных температурах и уровнях pH, фаги, выделенные в этом исследовании, рассматриваются как потенциальные кандидаты для in vivo контроля штамма E. coli O177. Однако необходимы дальнейшие исследования с использованием соответствующих моделей in vitro, и in vivo, , чтобы оценить эффективность E. coli O177-специфических фагов в снижении количества E. coli O177 у живых животных и мясных продуктов.Более того, анализ последовательности всего генома также необходим для определения присутствия нежелательных генов в этих фагах.

Заявление о доступности данных

Наборы данных, созданные для этого исследования, доступны по запросу соответствующему автору.

Заявление об этике

Заявление «Этическое разрешение» было получено от этического комитета факультета естественных и сельскохозяйственных наук Северо-Западного университета до начала исследования. Исследованию был присвоен этический номер NWU-01223-19-S9.

Взносы авторов

VM и CA разработали и спланировали эксперименты, предоставили реагенты, материалы и инструменты для анализа. ПМ проводил эксперименты. PM, VM и CA написали документ и анализ данных.

Финансирование

Это исследование было поддержано Национальным исследовательским фондом (номер гранта: 112543) и стипендией для аспирантов Северо-Западного университета.

Конфликт интересов

Авторы заявляют, что исследование проводилось при отсутствии каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могут быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.

Благодарности

Авторы выражают благодарность д-ру Анин Йордан за ее техническую поддержку во время анализа ПЭМ на бактериофаги и г-ну Б. Дж. Морапеди за его помощь в сборе проб.

Список литературы

1. Ахтар М., Виазис С., Диез-Гонсалес Ф. Выделение, идентификация и характеристика литических бактериофагов широкого диапазона хозяев из сточных вод против сероваров Salmonella enterica . Контроль пищевых продуктов. (2014) 38: 67–74.DOI: 10.1016 / j.foodcont.2013.09.064

CrossRef Полный текст | Google Scholar

2. Хуанг Ч., Ши Дж., Ма В., Ли З., Ван Дж., Ли Дж. И др. Выделение, характеристика и применение нового специфического бактериофага Salmonella в различных пищевых матрицах. Food Res Int. (2018) 111: 631–41. DOI: 10.1016 / j.foodres.2018.05.071

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

4. Харада Л.К., Сильва Е.С., Кампос В.Ф., Дель Фиол Ф.С., Вила М., Дабровска К. и др.Биотехнологическое применение бактериофагов: современное состояние. Microbiol Res. (2018) 212–3: 38–58. DOI: 10.1016 / j.micres.2018.04.007

CrossRef Полный текст | Google Scholar

5. Ниу Й, Джонсон Р., Сюй Й., Макаллистер Т., Шарма Р., Луи М. и др. Диапазон хозяев и литическая способность четырех бактериофагов против бычьих и клинических человеческих изолятов токсина Shiga, продуцирующего Escherichia coli O157: H7. J Appl Microbiol. (2009) 107: 646–56. DOI: 10.1111 / j.1365-2672.2009.04231.x

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

6. Ахтар М., Виазис С., Кристенсен К., Кремер П., Диц-Гонсалес Ф. Выделение, характеристика и оценка вирулентных бактериофагов против Listeria monocytogenes . Контроль пищевых продуктов. (2017) 75: 108–15. DOI: 10.1016 / j.foodcont.2016.12.035

CrossRef Полный текст | Google Scholar

7. Инь И, Лю Д., Ян С., Алмейда А., Го Ц., Чжан З. и др.Потенциал бактериофага против биопленок Vibrio parahaemolyticus . Контроль пищевых продуктов. (2019) 98: 156–63. DOI: 10.1016 / j.foodcont.2018.11.034

CrossRef Полный текст | Google Scholar

8. Ateba CN, Bezuidenhout CC. Характеристика штаммов Escherichia coli O157 от людей, крупного рогатого скота и свиней в Северо-Западной провинции, Южная Африка. Int J Food Microbiol. (2008) 128: 181–8. DOI: 10.1016 / j.ijfoodmicro.2008.08.011

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

9.Акиндолайр М., Бабалола О., Атеба С. Обнаружение устойчивого к антибиотикам Staphylococcus aureus из молока: значение для общественного здравоохранения. Int J Environ Res Public Health. (2015) 12: 10254–75. DOI: 10.3390 / ijerph2204

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

10. Дламини Б.С., Монсо П.К., Кумар А., Атеба С.Н.. Распределение факторов вирулентности, детерминанты устойчивости к антибиотикам и молекулярный фингерпринт видов Salmonella , выделенных из образцов крупного рогатого скота и говядины: наводящие на размышления доказательства заражения мяса от животных. Environ Sci Pollut Res. (2018) 5: 32694–708. DOI: 10.1007 / s11356-018-3231-4

CrossRef Полный текст | Google Scholar

12. Барилли Э., Висмарра А., Вилла З, Бонилаури П., Баччи С. ESβL E. coli , выделенная в цепи свиней: генетический анализ, связанный с фенотипом и оценка синтеза биопленок. Int J Food Microbiol. (2019) 289: 162–7. DOI: 10.1016 / j.ijfoodmicro.2018.09.012

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

14.Фаррох С., Джордан К., Овре Ф., Гласс К., Оппегаард Х., Рейно С. и др. Обзор шига-токсина Escherichia coli (STEC) и их значение в молочном производстве. Int J Food Microbiol. (2013) 162: 190–212. DOI: 10.1016 / j.ijfoodmicro.2012.08.008

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

15. Гулд Л.Х., Моди Р.К., Онг К.Л., Клогер П., Кронквист А.Б., Гарман К.Н. и др. Повышенное признание инфекций Escherichia coli , не продуцирующих токсин O157 Shiga в США в период 2000–2010 гг .: эпидемиологические особенности и сравнение с E.coli O157 инфекции. Пищевой патоген. Дис. (2013) 10: 453–60. DOI: 10.1089 / fpd.2012.1401

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

16. Hungaro HM, Mendonça RCS, Gouvêa DM, Vanetti MCD, De Oliveira Pinto CL. Использование бактериофагов для уменьшения содержания Salmonella в коже цыпленка по сравнению с химическими агентами. Food Res Int. (2013) 52: 75–81. DOI: 10.1016 / j.foodres.2013.02.032

CrossRef Полный текст | Google Scholar

17.Чен Дж, Рен Й, Сео Дж, Лю Т., Банг В., Юк Х. Технологии вмешательства для обеспечения микробиологической безопасности мяса: текущие и будущие тенденции. Compr Rev Food Sci Безопасность пищевых продуктов. (2012) 11: 119–32. DOI: 10.1111 / j.1541-4337.2011.00177.x

CrossRef Полный текст | Google Scholar

18. Боатемаа С., Барни М., Дрими С., Харпер Дж., Корстен Л., Перейра Л. Пробуждение после кризиса листериоза: проблемы безопасности пищевых продуктов, практика и управление в секторе розничной торговли продуктами питания в Южной Африке. Контроль пищевых продуктов. (2019) 104: 333–42. DOI: 10.1016 / j.foodcont.2019.05.009

CrossRef Полный текст | Google Scholar

19. Сэмбрук Дж., Фрич Э. Ф., Маниатис Т. Молекулярное клонирование: лабораторное руководство. 2-е изд. Колд-Спринг-Харбор, Нью-Йорк: Лаборатория Колд-Спринг-Харбор Пресс (1989).

Google Scholar

20. Ван Твест Р., Кропинский AM. Обогащение бактериофагов из воды и почвы. В: Бактериофаги. Методы молекулярной биологии ™. Humana Press (2009). п. 15–21. DOI: 10.1007 / 978-1-60327-164-6_2

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

21. Редактор Адамса MH. Методы исследования бактериальных вирусов. Бактериофаги. Нью-Йорк, Нью-Йорк: Издательство Interscience (1959). п. 443–522.

Google Scholar

22. Sambrook J, Russell DW. Молекулярное клонирование: лабораторное руководство. 3-е изд. Колд-Спринг-Харбор, Нью-Йорк: Лаборатория Колд-Спринг-Харбор Пресс (2001).

Google Scholar

23. Zhang H, Yang Z, Zhou Y, Bao H, Wang R, Li T, et al. Применение фага для обеззараживания Vibrio parahaemolyticus устриц. Int J Food Microbiol. (2018) 275: 24–31. DOI: 10.1016 / j.ijfoodmicro.2018.03.027

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

24. Куттер Э. Диапазон хозяев фага и эффективность посева. В: Clokie MRJ, Kropinski AME, редакторы. Бактериофаги. Методы молекулярной биологии ™.Нью-Йорк, Нью-Йорк: Humana Press; Спрингер (2009). п. 501. DOI: 10.1007 / 978-1-60327-164-6_14

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

25. Манохар П., Сталсби Лундборг С., Тамханкар А.Дж., Нахимуту Р. Терапевтическая характеристика и эффективность коктейлей с бактериофагами, заражающих видов Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae и Enterobacter видов. Front Microbiol. (2019) 10: 574. DOI: 10.3389 / fmicb.2019.00574

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

27.Ackermann HW. Классификация и характеристика фагов. В: Clokie MRJ, Kropinski AM, редакторы. Бактериофаги: методы и протоколы, Том 1: Выделение, характеристика и взаимодействия. Тотова, Нью-Джерси: Humana Press; Спрингер (2009). п. 127–40. DOI: 10.1007 / 978-1-60327-164-6_13

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

28. Эль-Дугдуг Н.К., Кучич С., Абдельхамид А.Г., Бровко Л., Кропински А.М., Гриффитс М.В. и др. Контроль Salmonella Newport на помидорах черри с использованием коктейля литических бактериофагов. Int J Food Microbiol. (2019) 293: 60–71. DOI: 10.1016 / j.ijfoodmicro.2019.01.003

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

30. Рао Б.М., Лалита К. Бактериофаги для аквакультуры: полезны они или вредны. Аквакультура. (2015) 437: 146–54. DOI: 10.1016 / j.aquaculture.2014.11.039

CrossRef Полный текст | Google Scholar

31. Перейра С., Морейринья С., Левика М., Алмейда П., Клементе С., Кунья А. и др. Бактериофаги с потенциалом инактивировать Salmonella Typhimurium : использование отдельных фаговых суспензий и фаговых коктейлей. Virus Res. (2016) 220: 179–92. DOI: 10.1016 / j.virusres.2016.04.020

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

32. Niu YD, McAllister TA, Nash JH, Kropinski AM, Stanford K. Четыре Escherichia coli O157: фаги H7: новый род бактериофагов и таксономическая классификация T1-подобных фагов. PLoS ONE. (2014) 9: e100426. DOI: 10.1371 / journal.pone.0100426

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

33.Перера М.Н., Абуладзе Т., Ли М., Вулстон Дж., Сулаквелидзе А. Бактериофаговый коктейль значительно снижает или устраняет Listeria monocytogenes заражение салатом, яблоками, сыром, копченым лососем и замороженными продуктами. Food Microbiol. (2015) 52: 42–8. DOI: 10.1016 / j.fm.2015.06.006

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

34. Снайдер А.Б., Перри Дж. Дж., Юсеф А. Э.. Разработка и оптимизация обработки бактериофагами для борьбы с энтерогеморрагической Escherichia coli в свежих продуктах. Int J Food Microbiol. (2016) 36: 90–7. DOI: 10.1016 / j.ijfoodmicro.2016.07.023

CrossRef Полный текст | Google Scholar

35. Duc HM, Son HM, Honjoh KI, Miyamoto T. Выделение и применение бактериофагов для уменьшения загрязнения сырого куриного мяса сальмонеллами. LWT. (2018) 91: 353–60. DOI: 10.1016 / j.lwt.2018.01.072

CrossRef Полный текст | Google Scholar

36. Трункайте Л., Шимолюнас Е., Заянчкаускайте А., Калиниене Л., Манкявичюте Р., Станюлис Дж. И др.Бактериофаг vB_EcoM_FV3: новый член «rV5-подобных вирусов». Arch Virol. (2012) 157: 2431–5. DOI: 10.1007 / s00705-012-1449-x

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

37. Сингх А., Арья С.К., Гласс Н., Ханифи-Могхаддам П., Найду Р., Шимански С.М. и др. Белки-хвосты бактериофагов в качестве молекулярных зондов для чувствительного и селективного обнаружения бактерий. Biosens Bioelectron. (2010) 26: 131–8. DOI: 10.1016 / j.bios.2010.05.024

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

38.Hu Z, Meng XC, Liu F. Выделение и характеристика литических бактериофагов против Pseudomonas spp., Нового биологического вмешательства для предотвращения порчи сырого молока. Int Dairy J. (2016) 55: 72–8. DOI: 10.1016 / j.idairyj.2015.11.011

CrossRef Полный текст | Google Scholar

39. Сталин Н., Сринивасан П. Эффективность потенциальных фаговых коктейлей против видов Vibrio harveyi и близкородственных видов Vibrio , выделенных из среды аквакультуры креветок на юго-восточном побережье Индии. Vet Microbiol. (2017) 207: 83–96. DOI: 10.1016 / j.vetmic.2017.06.006

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

40. Калацис П.Г., Бастиас Р., Коккари С., Катариос П. Выделение и характеристика двух литических бактериофагов, ϕSt2 и ϕGrn1; применение фаготерапии для биологической борьбы с вибрионом alginolyticus в живых кормах для аквакультуры. PLoS ONE. (2016) 11: e0151101. DOI: 10.1371 / journal.pone.0151101

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Lysis — обзор | ScienceDirect Topics

ВВЕДЕНИЕ

Лизис эпидуральных спаек — это интервенционный метод обезболивания, который со временем развивался [1].Цель лизиса эпидуральных спаек — разрушить барьеры в эпидуральном пространстве, которые, как считается, способствуют болезненным процессам и предотвращают доставку обезболивающих лекарств к целевым участкам. Методика, которая была впервые описана и до сих пор используется наиболее часто, основана на введении судоходного катетера в эпидуральное пространство. Совсем недавно эпидуроскопия была представлена ​​как альтернативный или дополнительный подход к катетерной технике. Процедура лизиса проводится по всей оси позвоночника, но лизис с помощью эпидуроскопии обычно ограничивается поясничной и крестцовой областями.Эта глава посвящена осложнениям, связанным с лизисом для лечения боли в пояснице и радикулопатии нижних конечностей с поражением поясничного и крестцового сегментов.

Целью лизиса эпидуральных спаек является уменьшение механических барьеров, препятствующих попаданию лекарств в ганглии дорзального корня. Техника возникла из наблюдений во время инъекции под визуальным контролем. Было очевидно, что у некоторых пациентов образование рубцовой ткани препятствовало инъекции жидкости или установке катетера рядом с спинномозговыми нервами.Сенсорный блок, который развивается при введении эпидурального местного анестетика для проведения хирургической анестезии, обезболивания или обезболивания при родах, как правило, симметричен, что позволяет предположить, что распространение местного анестетика в этой популяции относительно равномерно. Однако у пациентов с хронической болью в спине распространение контраста было неравномерным, с большими дефектами наполнения, наблюдаемыми у многих пациентов. Жидкость, помещенная в эпидуральное пространство, будет следовать по пути наименьшего сопротивления и не будет распространяться в места, где есть препятствие, вызванное рубцовой тканью.Если катетер помещали в непосредственной близости от наблюдаемой рубцовой ткани и вводили местный анестетик, рентгеноконтрастное вещество и другие жидкости, часто следовало обезболивание, и продолжительность обезболивания значительно превышала продолжительность местного анестезирующего эффекта. Введение инъекций большого объема в эпидуральное пространство часто приводило к длительному облегчению боли и более равномерному распределению контраста по эпидуральному пространству. Это предполагает, что размещение жидкости в эпидуральном пространстве может привести к уменьшению или устранению механических барьеров, вызванных рубцеванием.

В 1991 году Kuslich et al. очертили чувствительные к боли структуры позвоночного канала при проведении хирургических ламинэктомий под местной анестезией [2]. Используя механическую, а также электрическую стимуляцию, они обнаружили, что чувствительные к боли структуры включают кольцо, нервные корешки, фасеточные суставы, заднюю продольную связку, сухожильные прикрепления мышц (но не сами мышцы), связки и фасции. Они также обнаружили, что нервные корешки болезненны, если они сдавлены, опухли, воспаляются или ограничены рубцовой тканью.Нервы в 3,2 раза чаще вызывают корешковую боль, если они окружены рубцовой тканью [3]. Область бокового углубления — это место выхода нервных корешков из позвоночного канала. Эти корни подвержены травмам из-за образования рубцов, гипертрофических фасеточных суставов, выпуклых дисков и многочисленных осложнений, связанных с хирургической и инъекционной техникой [1]. Начиная с наблюдений Куслича и др. Вентролатеральное эпидуральное пространство постепенно стало признаваться как место-мишень для лечения во время лизиса эпидуральных спаек.Разработка навигационного рентгеноконтрастного катетера с мягким наконечником, устойчивого к изгибам, позволила большинству пациентов разместить его на этом целевом участке или рядом с ним. Однако существует ряд осложнений, связанных с лизисом эпидуральных спаек. В некоторых случаях использование больших объемов эпидурального пространства вызывает баротравму содержимого позвоночного канала, включая спинной мозг, нервные корешки и кровоснабжение спинного мозга.